蚕素Bbx-b4在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及功能研究.docVIP

  蚕素 Bbx-b4 在家蚕杆状病毒表达系统中的 表达及功能研究# 陈维芹1,2，舒特俊1,2，陈剑清1,2，于威1,2，张耀洲1,2** 5 10 15 20 25 30 35 40 45 （1. 浙江理工大学生命科学学院，杭州 310018； 2. 浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室，杭州 310018） 摘要：从本实验室构建的 cDNA 文库中查找到一条阅读框为 273bp 的，编码 90 个氨基酸残基 的基因序列，经氨基酸同源性比对发现其为蚕素 Bbx-b4 基因序列。与胰岛素在结构和功能 上都具有很大的同源性，由信号肽、B 链、C 肽和 A 链组成。天然蚕素切除信号肽和 C 肽， 由 A 链和 B 链组成，A 链和 B 链之间以二硫键相连，分子量约为 4.0kDa。将 Bbx-b4 基因与 家蚕杆状病毒多角体蛋白 Polh 基因融合，克隆到表达载体 pET-28a（+）上，在大肠杆菌 BL21(DE3)中融合表达，利用多角体特点，通过调节缓冲液 PH 溶解包涵体和镍柱亲和层析的 方法进行蛋白初步纯化，将纯化的重组蛋白免疫新西兰雄兔制备多克隆抗体；同时将 Bbx-b4 基因克隆到 pFastBac1 中，构建重组质粒，在家蚕细胞 BmN 中表达。Tricine-SDS和 Western blotting 检测 Bbx-b4 在家蚕细胞 BmN 和蚕蛹中的表达情况。流式细胞分析细胞周 期实验表明 Bbx-b4 具有促进细胞生长的功能；四氧嘧啶高血糖小鼠降血糖实验表明家蚕中 表达的 Bbx-b4 具有一定的降血糖活性，但是较正常蚕蛹活性不显著。 关键词：分子生物学；家蚕；Bbx-b4；多角体融合表达；家蚕杆状病毒表达系统；降血糖活 性 中图分类号：Q78 The expression and function reacher of Bbx-b4 in silkworm baculovirus expression system CHEN Weiqin1,2, SHU Tejun1,2, CHEN Jianqing1,2, YU Wei1,2, ZHANG Yaozhou1,2 (1. Insititute of Biochemistry,College of Life Science,Zhejiang Sci-Tech University, HangZhou 310018; 2. Zhejiang Provincical Key Laboratory of Silkworm Bioreactor and Biomedicine, HangZhou 310018) Abstract: We found the Bbx-b4 gene from the cDNA library constructed by our laboratory. After Blasten based on NCBI database and alignment of deduced amino acid sequence homology，it was found to be the Bbx-b4 gene.Its open reading frame（ORF）is 273 bp and encod 90 amino acids . Bombyxin and human insulin are so similar that they have the same tertiary structure. Its molecular weight is about 4.0kDa. We cloned the fusion gene of Bbx-b4 and gene Polh(polyhedrin,Polh) into the vector pET-28a and pFastBac1 to construct recombinant plasmid, and the fusion protein was expressed by E.coil system and Bombyx mori NPV expressing system, respectively. The fusion protein expressed in the E.coil syste remained as inclusion body. According to the principle of the alkali fusion of Polh protein,we purified the fusion protein by dissolving inclusion protein in different PH buffer solution and