生物技术专业毕业论文--细菌视紫红质基因的克隆及鉴定.docVIP

摘 要 目的：为了探讨细菌视紫红质基因克隆工程，构建含该基因的重组质粒，可以通过克隆型载体pUC18为构建重组质粒的载体，选择质粒pUC19中的细菌视紫红质基因bop为目的基因，利用分子生物学相关技术构建pUC18－bop重组质粒，为细菌视紫红质基因的测序及细菌视紫红质基因的表达等后续实验做准备。方法：用小量制备质粒DNA的方法分别提取克隆型质粒载体pUC18和含细菌视紫红质基因bop的质粒pUC19，取提取的克隆型质粒载体pUC18进行1％琼脂糖凝胶电泳，以质粒pUC19-bop为摸板扩增bop基因，设计PCR[1]上下游引物时分别加入限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ酶切位点，PCR反应条件[2]为： 25μL PCR反应体系中含模板DNA0.5μL ，上下游引物各0.5μL，Taq酶1μL，dNTP0.5μL，10×buffer 2.5μL，蒸馏水19.5μL。反应参数为： 95℃变性5 min，按如下参数循环30次：94℃变性30s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min 30s。进行PCR扩增后产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，取分子量为1200bp左右片断进行胶回收及纯化。纯化后的克隆型质粒载体pUC18与细菌视紫红质基因bop分别用限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ进行双酶切，20μL酶切体系为：载体pUC18或目的基因bop 15μL，限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ各1.5μL，10×buffer 2μL。酶切体系在37℃水浴箱过夜。取酶切后取载体pUC18 2μL，目的基因bop 12μL，T4连接酶1μL，16℃恒温水浴过夜连接。取连接产物5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳初步鉴定。取制备好的感受态菌100μL加入10μL连接产物混匀，静置冰浴lOmin ，42℃水浴90s进行热休克后立即冰浴2min，加入含氨苄青霉素（0.1g/ml）LB琼脂平板，37℃恒温培养箱培养过夜，筛选阳性单克隆，传代培养后提取重组质粒鉴定。结果： pUC18－bop重组质粒用化学法转化入大肠杆菌DH5α后，以培养菌液做PCR鉴定，将PCR扩增后产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到约1200bp的bop片段，提取重组质粒进行1％琼脂糖凝胶电泳目的条带，与标准Marker相比较分子量约为3000bp，与预计大小一致；取重组质粒pUC18－bop 10μL，限制性核酸内切酶BamH I和Hind Ⅲ各1μL，10×buffer 2μL，蒸馏水6μL。酶切体系在37℃水浴箱过夜处理。取酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳得到约1200bp(bop基因)和2800bp(pUC18)片断，与预计大小一致。结论：成功构建pUC18－bop重组细菌视紫红质基因，经特异性PCR扩增鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，限制性核酸内切酶双酶切鉴定证实重组质粒构建成功。 关键词：克隆型质粒载体pUC18；PCR聚合酶链反应；细菌视紫红质基因 Abstract objective: In order to approach the cloning project of the bacteriorhodopsin gene. To choose the expression vector pUC18 and the bacteriorhodopsin gene as target gene toconstruct recombinant plasmid. Taking use of molecular biology gene engineeringmethods，to construct recombinant plasmid pUC18-bop, prepare for the latter experiment． method：Extract the plasmid pUC18 and pUC19-bop，after 1% agarosegel electrophoresis．The pUC19-bop fragment was amplified with PCR from the genome bop．When the PCR primers of bop were designed，the lateral sides of primers were decorated with restriction endonuclease BamH I and Hind Ⅲ sequences．The reactive system was composed of the genome DNA of pUC19-bop 0.5μL，dNTP0.5μL,Tag DNA polymerized enzyme0.5μL，two of primers 0.5μL，10×bu