质粒DNA的提取鉴定与转化.pdfVIP

分子生物学综合实验 质粒DNA的提取、鉴定与转化 学时：18 概　　述 　　要把一个有用的外源基因通过基因工程手段， 送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具， 携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体 （vector ）。 　　载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基 因工程的载体必须具备下列条件： （1 ）是一个复制子，载 体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2 ）载 体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因 在受体细胞中大量扩增；（3 ）载体DNA链上有l到几个限制 性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入； （4 ）载体具有选择性的遗传标记，根据标记，从而知道目 的基因是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞 从其他细胞中分离筛选出来。由于细菌质粒具备上述条件， 因而它已成为基因工程中常用的载体之一。 载体(Vector)： 用于携带重 组DNA ，并 且能够使外 源DNA一起 复制与表达 的质粒(运载 工具) 。 质粒(Plasmid) ：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传 因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些 动植物细胞中，在细菌细胞中最多。质粒具有自主复制性、不相容性、多 拷贝性、转移性、选择性遗传标记、质粒DNA链上有1到几个限制性内切 酶单一识别位点等特点。它可独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染 色体中，它离开宿主细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对 宿主细胞的补偿。 质粒类型： 1. 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下 的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细 胞中只有一份或几份拷贝； 2. 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之 下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药 物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几 千份。如较早的质粒pBR322 即属于松弛型质粒，要经过 氯霉素处理才能达到更高拷贝数。 一、实验目的： 大肠杆菌在LB培养基上培养，用碱性裂解法快速从大 肠杆菌细胞中分离、提取、纯化质粒DNA。用紫外吸 收法测定质粒DNA含量；用琼脂糖凝胶电泳法鉴定其 纯度；用质粒转化实验，检测质粒的生物活性。 通过本实验使学生能熟练掌握质粒的提取纯化、限制性 内切酶酶切、琼脂糖凝胶电泳、大肠杆菌感受态细胞制 备及转化等方法和技术。 二、实验流程 细菌培养物的生长 细菌的收获和裂解 质粒DNA的纯化 大肠杆菌感受态细胞的制备 质粒DNA的鉴定 质粒DNA的转化 ？ 筛选转化子和计算转化率 思考和总结 三、实验准备 1、仪器和材料 微量加样器、无菌工作台、高压锅、低温高速离 心机等； 1.5mL塑料离心管、枪头、培养皿（需高温灭 菌）； 实验材料：大肠杆菌PBLGC，含抗卡那霉素基因 质粒。 2、试剂 LB培养基，配2000ml 。成分如下：每升含有胰蛋白胨 10g，酵母提取物5g，NaCI 10g，琼脂糖或琼脂（固体 培养基时用）15g，用10mol/LNaOH调pH至7．0。高 压灭菌30min。 pH8.0 GET缓冲液，配100ml。成分如下：50mmol ／ L葡萄糖，10mmol ／L EDTA (pH8.0)，25 mmol ／L Tris －HCl(pH8.0)。高压灭菌30min。 pH4．8 乙酸钾溶液，配100ml。成分如下：60mL 5mol ／L KAc，11.5mL冰醋酸，28.