植物生理与分子生物学课件-1009新.pdfVIP

• BAC和PAC载体系统的优点： 1.克隆的容量差不多，都能接受100-300kb的外源 DNA ； 2.克隆DNA 以超螺旋形式存在，DNA抽提简单，可以 避免细菌基因组DNA 的污染； 3.质粒比较稳定，很少发现质粒的重组、缺失现象； 4.文库的嵌合比例较低； 5.质粒可直接用于基因组测序； 6.文库构建比较简单，都利用电转化系统构建 质粒文库，BAC库可用蓝白斑筛选，PAC库 用蔗糖进行直接筛选； 7.应用广泛，目前世界上的基因组文库大多用 BAC或PAC 。 3 基因组测序 • 基因组测序的方法有两种：克隆步移法和全基因组 鸟枪法 • 克隆步移法用于真核高等动植物的大基因组测序， 如人类、水稻、拟南芥等 • 全基因组鸟枪法仅用于原核与单细胞真核等小基因 组的测序，如嗜热杆菌、大肠杆菌、酵母菌等，现 在也用于大基因组测序 • 随着测序技术的逐步成熟和测序成本的逐 渐降低，近年来基因组序列数据每年呈指 数形式增长。 • 据2007年1月数据，全球已启动2296个基 因组项目，其中607个已完成，481个已公 开发表基因序列。 • 无论是全基因组鸟枪法还是采用克隆步移 法进行测序，得到的都是成百上千万的小 片段DNA序列，最后必须要将它们组装成 基因组每条染色体上真实的排列顺序，这 是手工操作无法完成的，需要借助计算机 和数据库以及相关软件系统。 4 基因组序列的解读 4.1 基因组注释概述 • 基因组注解异常复杂，它是一个繁杂的复合 体，既包含了进化历史上原封未动的部分， 也有大量的进化史上重要历史事件的遗迹。 • 与数据库中已知序列比较，基因组的序列可 分为3类： – 确知其生理功能的 – 有相匹配的蛋白质序列，但并不知道其功能的 – 在现有数据库中找不到任何相匹配的蛋白质序列 的新基因 • 基因组序列注解是一个复杂的过程，分成3个 层次： a. DNA层次 （where ，即在基因组序列中，基因在哪 里？它是如何转录并拼接的？每个外显子的具体边 界在哪里？） b. 蛋白质层次 （what ，即这个基因编码的蛋白质是什 么？它有什么样的一级、二级甚至是三级结构？） c. 代谢调控过程层次 （how ，即这个蛋白质如何形式 功能？它参与了什么样的代谢或者调控过程？） • 中心法则： 在真核生物中，遗传信息从基因组DNA转录成 pre-mRNA ，后者经过拼接、戴帽、加尾等加工变成 成熟的mRNA ，mRNA从细胞核进入细胞质中，在 这里被翻译成蛋白质，然后该蛋白质到达它的靶位 点行使相应的生物学功能。 4.2 核苷酸水平上的分析 4.2.1 基因预测软件以及全长cDNA和EST数据 的分析 • 数据预测的标准： 预测的敏感性 （sensitivity ） 预测的专一性 （specificity ） • 为什么一个基因组测序完成后，不同人给出 的基因数目差异很大呢？ 平均而言，在核苷酸水平、外显子水平和全基因水 平的预测准确率分别为80%、45%和20%。 不同的预测软件也不具有可比较性，每种软件都有 自己的针对性，它们的准确性极大地依赖于软件开 发时所采用的有限的已知数据，即训练数据 （training data ）。 • 只有EST或全长cDNA序列才能够判定一个基因预测 的准确性。 • 由于cDNA建库过程中只能克隆到那些高表达的持 家基因，许多低表达基因和组织特异性表达的基因 无法克隆到，因此，大量的预测基因无法得到EST的 证实。 • 另外，除非预测软件能够鉴定出所有的选择性拼接 产物以及所有的转录顺式调控元件，否则基因预测 永远都是不完整的，也无法准确指出某个基因组里 面到底含有多少基因。 • 与软件预测结果不同，由于EST数据来自基因的转录 本，它是序列注解过程中最为可靠的支持证据，能 够提供最充分的基因结构信息，因此，大规模的基 因组测序计划往往伴随着cDNA文库，尤其是全长 cDNA文库的构建与测序计划。 • 将EST与基因组序列进行比较分析，可以很容易地鉴 定出外显子及其准确边界， • EST还可以帮助判断基因上下游的非翻译区(UTR)