分子生物学在分支杆菌检测中的应用.pptVIP

分枝杆菌的检测 目标 : 了解分枝杆菌 感染相关的流行病学数据 了解分枝杆菌的不同种类 了解 实验室中的检测方法及局限性 分子生物学的应用 结核病例 世界上：8 百万新的感染者 / 年，3百万死亡者 / 年 我国：13万死亡者 / 年，结核病疫情次于印度，占世界第二位。 预期和观察到的 TB案例 美国, 1980-1992 肺结核现状 分枝杆菌感染 主要因素 : 年老的人群 贫穷的人群 吸毒人群 免疫缺陷人群(如 AIDS...) 旅游 + 移民 分枝杆菌感染 结核分枝杆菌 : 细菌学诊断 样本收集 样本处理 显微镜检查 培养 鉴定 药敏测试 实验室安全 个体：健康 非怀孕妇女 面具和手套 实验室和微生物室分开 分枝杆菌 : 传统方法 样本收集 细菌的传播可以是间断性的 : 需处理几个收集的样本 (至少3个系列标本) 痰, 肺泡液, 胃管 胸膜液 尿 (很多的白细胞, 阴性培养 ) CSF 穿刺液 : 关节,神经节 血液 样本的处理 处理 不同的处置 : Petroff 法: 4% NaOH Kubica法 : N 乙基-L 半胱氨酸 (NACL) + NaOH * 硫酸十二醇钠法 Zephiran法 : 氯苯甲羟胺 (生物梅里埃) 显微镜检查 – 抗酸染色 初次检查 : 对诊断来说是必须的, 由于细菌培养的速度很慢。 直接检查病理标本或经过样本处理的标本。 主要染色剂: Ziehl-Neelsen 染色剂 : 含有品红 Dugommier 染色剂 : 含有槐黄 (一种带荧光的染料) 显微镜检查 显微镜检查 – 抗酸染色 培养 培养 自动化 : Middlebrook培养基+ 抗生素 BD : Bactec 460 TB （辐射线测定) 9000 MB (荧光) MGIT 960 (荧光) 欧加侬 : BacT alert/3D (比色测定) 生长 : 约14天 培养 培养 具有较高的敏感性，是诊断中最好的方法 : 理论上, 样本中的一个细菌足够产生阳性结果。 需要几个星期获得结果 尽管治疗已经进行 培养可确认诊断, 鉴定种类， 并进行药敏检测。 传统鉴定 鉴定决定于 : 培养物出现所需时间 菌落的出现 : 结核分枝杆菌出现呈花椰菜样... 细菌的显微特性 (聚集成绳状或扭曲状..) 可能性着色 : 如非典型分枝杆菌 生化检测是结果 主要抗肺结核药物 比例方法: 将不同稀释度的样本接种于 含1-2个抗生素浓度的试管中 不含抗生素的试管中 比较研究含有和不含有抗生素的试管 : 菌落的记数 概要 感染的严重性 蔓延的问题 (病人的隔离) 治疗的费用 除结核杆菌外的其它种类发分离大量增长 由于直接检查而缺少敏感性, 培养和鉴定的缓慢, 基因扩增检测介绍 基因扩增基本所需 已知目标的碱基（基因）排列次序 酶 引物 (由大约20个核酸组成 ) 核酸 (用于构成新的DNA/RNA链) 基因扩增 - 原理 基因扩增所需的工具 变性 分离DNA双链 (90°C加热) 严格的反应环境要求 必须达到特定物理、化学环境要求 (温度、PH、离子浓度) 酶 碱基 (核糖核酸) 酶 DNA 聚合酶 制造对应 DNA 链 RNA 聚合酶 转录 DNA 至 RNA 反转录酶 RNA 至 DNA RNase H酶 降解 RNA/DNA 双合体内的 RNA 链 连接酶 连接 2 个 DNA 片段 裂解酶 在特有位置分割核酸链 主要扩增技术 PCR : 罗氏 Polymerase Chain reaction（聚合酶连反应） NASBA : Nucleic Acid Sequence Based Amplification ORGANON TEKNICA (欧加隆) TMA : Transcription- Mediated Amplification (GEN-PROBE，转录诱导扩增法) LCR : Ligase Chain Reaction ABBOTT (雅培，连接酶连反应) bDNA : branched DNA CHIRON (康宁) SDA : Strand Displacement Amplification BECTON DICKINSON (B.D. 丝条取代扩增法) 扩增 PCR 定义 什麽是污染源 ? 污 染 单方向工作流程 鉴定 / 新技术 直接用标本 扩增技术 培养后进行 杂和技术 影响扩增测试结果质量的因素 Gen-Probe 检测技术 当直接检测数量极少的微生物 ? 扩增 Gen-Probe 三种创新的技术增加检测的灵敏度和简易性 : 以 rRNA 为目标 TMA 扩