第九章_基因工程与干细胞工程.ppt

A.质粒(plasmid) 特点：a.分子量小，稳定，高拷贝数； b.有遗传标志，便于选择； c.有多个限制酶的单一切点——多克隆位点，便于外 源基因插入。 主要用作亚克隆载体（只能容纳10kb外源DNA片段） B.λ噬菌体(λbacteriophage, λphage) 细菌病毒 可容纳9-23kb外源DNA片段 C.粘粒质粒(cosmid) 是λDNA的cos区与质粒重新构建的载体，为双链环状DNA;克隆容量可达40-50kb D.M13噬菌体(M13 phage) 是一种大肠杆菌噬菌体 另外，在人类基因组计划中，还使用下面几种载体： E.酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC) 容量为：0.5-2MB F.细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC) 容量为：0.1-0.4MB G.噬菌体人工染色体(phage artificial chromosome,PAC) 2.表达载体（expressing vector）：将常用克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件（DNA序列），即成为表达载体，不仅可以将外源基因片段携带进入宿主细胞，而且可以在宿主细胞（受体细胞）中表达（转录和翻译）外源基因的载体。这类载体除具有克隆载体所具备的性质以外，还带有表达构件——转录和翻译所必需的DNA序列。 表达载体的种类 根据受体细胞不同，从而产生多种多样的表达载体: A.大肠杆菌表达载体 B.分枝杆菌表达载体 C.放线菌表达载体 D.酵母表达载体 E.哺乳动物表达载体 哺乳动物细胞表达载体是从克隆载体上发展起来的,含有必不可少的原核序列。 依据定义，基因工程的整个过程由工程菌（细胞）的设计构建和基因产物的生产两大部分组成（如图）。 但这之前，必须作好各方面的准备工作，包括：目的基因的制备（克隆或表达的基因）、载体的选择和制备、受体（表达系统：大肠杆菌、酵母、昆虫、哺乳动物）的准备等等。 四、基因工程的基本过程 其主要操作过程如下： （1）从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开（简称切）； （2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到载体分 子上，形成DNA重组分子（简称接）； （3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中 （简称转）； （4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简称增）； （5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（简称检）。 由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为： 切、接、转、增、检。 供体细胞 分离 外源DNA 酶切 外源基因 载体分子 连接 受体细胞 DNA重组分子 基因工程基本流程示意图 转化与扩增 重组转化子 鉴定与表达 工程菌或细胞 蛋白表达产物 工程菌或细胞培养 重组产物分离纯化 从上面的基本流程来看，基因工程的操作是很简单的，但其中涉及到许多关键性技术，如不同生物来源的DNA分子的切割与连接、DNA拼接反应的检测方法以及重组DNA分子导入受体细胞的方法等。有趣的是，这三项基本技术几乎是同时于20世纪70年代初发展起来的，并迅速导致了第一个DNA体外重组实验的诞生。 五、基因工程的发展历史 1972年美国Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV40 DNA、λ噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。翌年，美国斯坦福大学的Cohen和Boyer等人在体外构建出含有四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，该重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的诞生。正如Cohen在评价其实验结果时指出的那样，基因工程技术完全有可能使大肠杆菌具备其他生物种类所固有的特殊生物代谢途径与功能，如光合作用和抗生素合成等。 1.基因工程的诞生 出人意料的是，当时科学界对这项新技术诞生的第一个反应便是应当禁止有关实验的继续开展，其严厉程度远大于今天人们对人体克隆的关注。包括Cohen本人在内的分子生物学家们都担心，两种不同生物的基因重组有可能为自然界创造出一个不可预知的危险物种，致使人类遭受灭顶之灾。于是，1975年西欧几个国家签署公约，限制基因重组的实验规模。第二年美国政府也制订了相应的法规。至今世界上仍有少数国家坚持对基因重组技术的应用范围进行严格的限制。 然而，分子生物学家们毕竟不愿看到先进的科学技术葬送在自己手中。从1972年到1976年短短的四