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对α-淀粉酶的系统性研究 （云南大学 生命科学学院生命科学系 云南 昆明） 摘要：α-淀粉酶是一种重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业。本文通过一系列实验，对α-淀粉酶酶活力（碘比色法和DNS法）、α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测、菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定、产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验、α-淀粉酶酶蛋白的提取和纯化和酶（纯化后）生物学特性测定等七个方面的内容进行系统的研究，进一步加深了对该酶性质方面的理解，提高了实际操作能力。 关键字：α-淀粉酶，酶活力，菌株，正交试验 第一章 α-淀粉酶酶活力测定 通过对碘比色法和DNS法的学习，掌握α-淀粉酶酶活力测定的原理及操作步骤。 1.材料和方法 1.1 碘比色法 1.1.1材料：碘原液，比色稀碘液，标准比色碘液，pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，2%可溶淀粉溶液，标准糊精溶液，标准终点色溶液，蒸馏水，相关玻璃仪器（试管、移液管、滴管）等。 1.1.2原理：酶促催化反应分解淀粉等底物（反应物）产物为麦芽糖、糊精等。反应式：淀粉→红色糊精。淀粉及糊精检测原理：碘检测 淀粉（紫蓝色，30分子以上）→红色糊精（红棕色，7-30分子）→无色糊精，7分子以下）→麦芽糖（不显色）→葡萄糖（不显色） 1.1.3 方法： 1.2 DNS法 1.2.1材料：3，5-二硝基水杨酸氢氧化钠；酒石酸钾钠；重蒸苯酚；无水亚硫酸钠，标准麦芽糖溶液，0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液，1%马铃薯淀粉溶液，麦芽糖，蒸馏水，相关玻璃仪器等。 1.1.2原理：淀粉酶催化产生的还原糖（麦芽糖等）能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下： 淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位样品（重量或体积）在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 1.1.3 方法： 1.1.3.1 标准曲线的制作 相关试剂加入表： 试 剂 管 号 1 2 3 4 5 6 标准麦芽糖溶液 （mL） 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 （mL） 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 麦芽糖含量 （mg） 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 DNS试剂 （mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2 结果 计算公式： 2.1碘比色法 2.2 DNS法 N-酶液稀释倍数 10-反应时间为10min 将实验数据带入excel得到标准曲线方程：Y=0.545X-0.029 由方程和上式可计算出α-淀粉酶酶活力为500（u/ml） 蛋白质含量（mg/mL）=（1.45×A280－0.74×A260）×N A280=0.4 A260=0.42代入上式得蛋白质含量为27（mg/ml） 比酶活力为18.52（u/ml）. 3 讨论 通过对α-淀粉酶酶活力的测定，让我们掌握了碘比色法和DNS法测定酶活力，两种方法在不同的条件下有不同的适用范围，各自也有各自的优缺点。碘比色法在实验中要严格控制温度及反应时间，测定管及空白管不能混淆，以减少误差；在DNS法中，关键是标准曲线的正确制作，会利用相关软件求出回归方程，了解分光光度计的原理及操作方法。在以后的工作研究中具有重要意义。 第二章 α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化检测、菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定、菌株产酶培养基组成优化正交试验 1.材料和方法 1.1材料 马铃薯浸液，玉米淀粉，琼脂，可溶性淀粉，Na2HPO4 .12H2O，（NH4）2SO4 ，NH4Cl，豆粕粉浸出液，培养基，无菌吸管，无菌水，涂布器，CaCO3等。 1.2 方法 1.2.1 α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测 α-淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定 1.2.2.1初筛发酵培养 实验操作流程 产α-淀粉酶菌株产酶培养基组成优化正交试验 实验操作流程 结果 2.1α-淀粉酶产生菌株（细菌）的分离纯化及检测 2.1.1 样品平板菌落计数结果（表一） 稀释度 10-4 10-5 10-6 10-7 细菌总数 培养皿号 1 2 3 平均 1 2 3 平均 1 2 3 平均 1 2 3 平均 菌落数 无法计数 无法计数 81 85 87 84 23 15 5 14 CFU/g 4.2*108 菌落数 培养皿号 1 2 3 平均 1 2 3 平均 1 2 3 平均 1 2 3 平均 菌落数 无法计数 无法计数 0 1 0 0.3 1 2 0 1 CFU/g 1.67*106 产淀粉比例 4.0% 2.1.2