- 1、本文档共13页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
酵母操作手册
(一)酵母的冻存、复苏以及培养
注:本手册改编自商业化酵母操作方案,依据本实验条件修改,并不适合所有实验室!
培养基配方:
10X Dropout 1L) AA Name 所购数量 ( g ) 10X 浓度 (mg/L) 实称 (g) L-Isoleucine 5 300 0.3 L-Valine 25 1500 1.5 L-Arginine HCl 50 200 0.2 L-Lysine HCl 50 300 0.3 L-methionine 10 200 0.2 L-Phenylalanine 10 500 0.5 L-Threonine 10 2000 2 L-Tyrosine 25 300 0.3 L-Uracil 25 200 0.2 共计 5.5 将各AAs称量后,在研钵中磨合混匀,置于干净器皿中。
单独用AA筛选溶液 AA名称 体积 ( ml ) 浓度(mg/ml) 实称 (g) L-Adenine hemisulfate salt 100 2 0.2 100 X L-Histidine HCl monohydrate 100 2 0.2 100 X L-Leucine 100 10 1 100 X L-Tryptophan 100 2 0.2 100 X 过滤除菌 YPDA(1L) 浓度 实称 (g) Difco peptone 20 g/L 20 Yeast extract 10 g/L 10 Agar (for plates only) 20 g/L 20 Glucose 2% 20 Adenine hemisulfate 0.003% 15 ml 0.2%Ade
SD Media (1L) 浓度 实称 (g/ml) 加H2O至1000ml, 114℃,20min。 YNB 6.7 g Agar(for plates only) 20 g Glucose 2% 20 10X基本DO 粉剂 0.55 g 100X单独用AA 10 ml 1. 长期冻存:
无营养缺陷型的酵母株存在含25%甘油的YPDA中,然后冻存于-70冰箱中,若要保存大于一年,务必使温度不要低于-55。
转染质粒的营养缺陷型酵母株存在含25%甘油的相应的缺陷型培养基(SD)中,以避免质粒丢失。
制备方法:
用无菌牙签从琼脂板上将一个单克隆挑出,置于含200-500μlYPDA或SD的1.5ml离心管中,注意尽量使牙签上的菌落都涮在溶液中,然后盖好盖,在旋涡器上剧烈振荡混匀,再加入无菌甘油,使其终浓度为25%,再次振荡混匀,存于-70冰箱中。
2. 复苏:
准备一无菌1.5ml离心管,加入100-200μl YPDA或SD,用无菌牙签挑取些许冻存菌置于离心管中,稍微涮洗一下牙签(让挑取的冰屑融化),混匀后吸取100μl涂平板,30培养2-3天。
刚长出克隆的平板用封口膜密封后,在4可保存1-2个月。
注意:有时冻存的酵母可能沉到离心管底部,所以在复苏时,将其全部融化,然后振荡混匀,再复苏。
3.酵母的液体培养:
用无菌牙签挑取一个两个月以内的酵母克隆,每5ml液体培养基所需的克隆大小为2-3mm,所以,如果单个克隆不够,可以多挑几个。剧烈振荡,使酵母细胞分散到液体中,30,200rpm振荡培养16-18hr,但通常好像需要24hr,甚至更长才能达到稳定期(OD600 1.5),所以一般在上午开始摇,第二天下午收。
如果需要中期培养物,则将上面的稳定期培养物稀释到OD600 = 0.2-0.3之间,然后30,200rpm振荡培养3-5hr,此时的培养物OD600 = 0.4-0.6之间。可见酵母的细胞周期约为3-5hr。
(二)质粒转化酵母细胞手册
试剂配方:
单链Carrier DNA (SS-DNA)(2 mg/ml)
注意:你不需要将Carrier DNA超声切割,因为实验证明Carrier DNA越大效果越好!只要如下操作即可。
1200mg高分子量DNA(III型脱氧核糖核酸钠盐,鲑鱼精DNA,Sigma D1626),溶于100ml TE(10mM Tris.HCl, PH 8.0, 1.0mM EDTA)。先用10ml枪头吹吸使DNA湿化,然后用磁性转子于4℃缓慢搅拌过夜使其完全溶解;如果紧急,也可于室温剧烈搅拌2 – 3hr使其完全溶解。
2. 将其直接分装成1ml/管,储存在-20℃。
3. 使用之前,先取出一管沸水浴至少5分钟,然后迅速放置于冰上骤冷。
要点:
I:Carrier DNA沸水浴后可以用3至4次而不需要再次沸水浴。如果转化效率开始降低,请再将其沸水浴或重新换一管。
II:本
您可能关注的文档
最近下载
- 抖音直播手卡模板.pdf
- 小学英语课前三分钟活动方案.docx
- 购买商铺自营协议书.pdf VIP
- (高清版)B-T 3836.2-2021 爆炸性环境 第2部分:由隔爆外壳“d”保护的设备.pdf VIP
- Q/320582 ZD028-2020预应力混凝土方桩(螺锁式连接、焊接连接).docx
- Unit1+Personal+and+family+life-listening+and+speaking.(课件)-中职高一英语(高教版2021基础模块1).pptx
- 板式家具工序质量标准及检验规范.docx
- 以服务型党组织建设为引领-加强基层党组织建设.ppt VIP
- 危废应急预案.pdf VIP
- 2024年党员干部违规吃喝行为工作情况报告.docx VIP
文档评论(0)