百合三种主要病毒的RT-PCR 检测及脱毒技术研究.pdfVIP

Online system: 农 业 生 物 技 术 学 报 Journal of Agricultural Biotechnology 2013, 21(4): 489~497 DOI: 10.3969/j.issn. 1674-7968.2013.04.015 技术改进 Updated Technology 百合三种主要病毒的RT-PCR 检测及脱毒技术研究 陈进 李晓昕 袁雪 易瑾 罗弦 赵阳 义鸣放* 中国农业大学观赏园艺与园林系，北京100193 *通讯作者，ymfang@ 摘 要 百合病毒病是影响百合切花和种球产量与质量的关键问题之一，虽然在我国百合病毒检测和脱 毒技术的研究已经展开，但是在病毒检测中存在着检测病毒的种类较单一和检测结果出现假阴性等问 题；脱毒方面也存在操作难度大、脱毒率不高等缺陷。本研究以麝香百合杂种系品种雷山一号(Lilium longiflorumcv. Raizan 1)组培苗为试材，对侵染百合的3 种主要病毒：黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus, CMV)、百合无症病毒(Lilysymptomlessvirus, LSV)和百合斑驳病毒(Lilymottlevirus, LMoV)的多重RT-PCR 检测及病毒脱除技术进行了研究。根据百合18S rRNA 和3 种病毒的基因序列，设计了4 对特异引物，并 对多重RT-PCR 中的dNTPs 浓度、Mg2+ 浓度、TaqDNA 聚合酶浓度、退火温度和反应循环数等因素进行了 筛选和优化。结果表明，进行多重RT-PCR 的最佳反应体系为：dNTPs(2.5 mmol/L) 1.5 μL ，Mg2+(25 mmol/ L) 1.5 μL ，Buffer 1.875 μL ，cDNA 1 μL ，CMV、LMoV 、LSV 、18S 上、下游引物各0.5 μL ，TaqDNA 聚合酶 0.2 μL ，加H O 补足至25 μL 。最佳反应程序为：94℃预变性5 min ；94℃变性30 s，52.4℃退火30 s，72℃延 2 伸30 s，30 个循环；72℃延伸10 min ，4℃终止反应。由此建立了以百合18S rRNA 为内参照，同时检测 CMV、LSV 和LMoV 的多重RT-PCR 技术。黑暗、变温热处理结合试管鳞茎培养只对脱除百合植株CMV 有效，脱毒率达90% 以上；黑暗、变温热处理后，切取≤1 mm 的茎尖进行光培养能够有效脱除CMV、LSV 和LMoV 3 种病毒，脱毒率达到93.3% 。此脱毒方法具有操作简便、培养周期较短、脱毒率高等优点，可以 为百合脱毒苗的生产提供指导。 关键词 百合，多重RT-PCR ，病毒检测，脱毒 Study on Molecular Detection and Elimination of Three Lily(Lilium longiflorum) Viruses CHEN Jin LI Xiao-Xin YUAN Xue YI Jin LUO Xian ZHAO Yang YI Ming-Fang* Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture, China Agricultural University, Beijing 100193, China * Corresponding author, ymfang@ Abstract Viral diseases cause adverse effects on the yield and quality of lilies grown in China. However, we still cant detect and eliminate these viruses effectively. The viral detection methods used these days are either time- consuming and expensive or sometime provide false- negative results occasionally. On the other