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中国黄牛mtDNA cyt b基因进化分析 中国黄牛mtDNA cyt b基因进化分析 生物学实验教学中心 目 录 引言 1 1 实验材料 1 2 实验方法 1 2.1血样采集和DNA样品制备 1 2.2 PCR引物 1 2.3 PCR反应和PCR产物检测 1 2.4 PCR产物回收测序 1 2.5数据分析与结果处理 1 3 结果与分析 1 3.1 1 3.2中国黄牛mtDNA cytB基因PCR扩增结果。 1 3.3 .中国黄牛mtDNA cytB基因序列分析结果。 1 3.4 . 中国黄牛mtDNA cytB分子进化分析，进化树的构建。 1 总结 1 参考文献 1 中国黄牛mtDNA cyt b基因分子进化分析 黄牛mtDNA cyt b基因MN（闽南）。 关键词：黄牛 线粒体 细胞色素B DNA 进化 Key words: yellow-cattle mitochondrion mtDNA cyt b DNA origin中国黄牛mtDNA cyt b基因进化分析 黄牛mtDNA cyt b基因仪、冷冻高速离心机、水浴振荡器(哈尔滨)、移液器(包括1000 μL，200 μL，100 μL，20 μL，10 μL，2.5 μL系列)、稳压稳流电泳仪、冰箱、台式高速离心机、凝胶成像仪(美国)、电子天平、超纯水仪等。 Taq DNA Polymerase, dNTP (dATP；dTTP；dCTP；dGTP)，l 0×bufferMgCl2、引物、EDTA、无水乙醇(Ethanol)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、SDS、Tris饱和酚(H8.0 )、蛋白酶K ( Proteinase K ) 、普通琼脂糖(Agrose)、DL-2000 Maker、氯仿、硼酸、溴化乙锭(EB)、溴酚兰、NaOH、HCl。mtDNA cyt b基因琼脂糖凝胶电泳法检测DNAPCR引物PCR产物检测与序列测定 ，上海生工生物公司数据处理.1血样采集和DNA样品制备 血样DNA的提取与分离 (1) 冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500 μL至1.5 mL Eppendorf管，加入等体积PBS液，充分混匀，12 000 r/m离心10 min (4)，弃去上清液，重复上述步骤至上清夜透明、沉淀呈淡黄色。 (2) 在离心管中加入DNA抽提缓冲液500 μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37水浴1 h。 (3) 加蛋白酶K μL (20 mg/mL)并混匀55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加5 μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清。 (4) 将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500 μL，温和摇动离心管20 min，使其充分混匀；4，12000 r/m离心10 min，将上清液转入另一1.5 mL离心管中，重复一次。 (5) 加氯仿500 μL，充分混匀20 min，4，12000 r/m离心10 min，将上清液转入另一1.5 mL离心管中。 (6) 加氯仿异戊醇混合液(24:1) 500 μL，充分混匀20 min，4，12000 r/m离心10 min，将上清液转入另一1.5 mL离心管中。 (7) 加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20保存30 min～60 min。 (8) 4，12000 r/m离心10 min，弃上清液，用体积分数70%的冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。 (9) 4，12000 r/m离心10 min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净，约3～4 h。 (10)干燥后的DNA溶于80～100 μL的TE液，4保存直至DNA完全溶解。 (11) 8 g/L琼脂糖凝胶电泳检测其质量，待分光光度计测定浓度后，-80保存。 DNA质量检测琼脂糖凝胶电泳法检测DNA： (1) 将凝胶电泳槽清洗干净，用胶带纸将两端封住，插上挡板和梳子。 (2) 称取0.32 g琼脂糖，转入锥形瓶中，加入1×TBE 40 mL使其悬浮，微波炉中火力60，微波加热80 s溶解。 (3) 当溶液温度降至约60时，加入EB溶液至终浓度为0.5 μg/mL，混匀。 (4) 立即将琼脂糖溶液倒入胶槽，如出现气泡，立即用移液器将气泡排出。 (5) 完全冷却凝固(约30～45 min)后，拔掉梳子，去掉两端胶带纸，将凝胶移入电泳槽中。 (6) 向电泳槽中加入1×TBE缓冲液，使液面高出胶面2～5 mm。 (7) 取DNA样品3 μL，加1 μL上样缓冲液(溴酚蓝)，混匀。 (8) DNA Marker：2 μLλDNA/Hind，混匀。 (9) 将样品和λDNA/Hind，分别