[分析化学]_第12章 荧光分光光度法.pptVIP

第十二章 荧光分析法 一、荧光与磷光的产生过程 luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence 2.电子激发态的多重性 3.激发态→基态的能量传递途径 非辐射能量传递过程 辐射能量传递过程 二、激发光谱与荧光(磷光)光谱 excitation spectrum and fluore-scence spectrum 2.荧光光谱(或磷光光谱) 3.激发光谱与发射光谱的关系 三、荧光的产生与分子结构的关系 relation between fluorescence and molecular structure 2.化合物的结构与荧光 3、荧光试剂 提高测定的灵敏度和选择性 荧光胺（fluorescamine):脂肪族和芳香族伯胺形成高度荧光衍生物 邻苯二甲醛：伯胺、氨基酸 丹酰氯：伯、仲胺及酚基的生物碱 测定无机离子的荧光试剂：荧光配合物 四、影响荧光强度的因素 4、荧光熄灭剂引起荧光熄灭的物质：卤素离子、重金属离子等相互碰撞损失能量；生成不发光的配合物；荧光物质被氧化；浓度大，自熄灭现象。荧光熄灭法：如果一个荧光物质在加入某种熄灭剂后，荧光强度的减弱和荧光熄灭剂的浓度呈线性关系，可对荧光熄灭剂进行含量测定。5、散射光光子和物质分子碰撞向不同的角度散射瑞利光：无能量交换，光子运动方向改变，波长不变拉曼光：有能量交换，光子运动方向改变，波长改变对测定的干扰：尤其是拉曼光，和荧光的波长接近（选择适当的激发波长来消除） 一、仪器结构流程 仪器光路图 仪器的校正灵敏度校正：能检测出的最低信号表示最低信噪比的最低浓度表示稳定的荧光物质校正：蓝色荧光可用硫酸奎宁的稀硫酸溶液，黄绿色荧光可用荧光素 钠水溶液，红色荧光可用罗丹明B水溶液 波长校正光学系统、检测器变动、长时间使用或更换部件，对波长刻度进行校正（汞灯的标准谱线）激发光谱和荧光光谱的校正光源强度随波长变化检测器的感应与波长不成线性校正装置：调整每一波长的光源强度 二、荧光分析方法与应用 2.定量依据与方法 （2）定量方法 3.荧光分析法的应用 三、磷光分析法的应用 第二节 荧光分光光度计 滤光片荧光计 滤光-单色器荧光计 荧光分光光度计 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 光源：氙灯和高压汞灯 单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器 样品池：石英 检测器：光电倍增管 干扰的排除 荧光分析法因灵敏度高，故干扰因素也多。溶剂不纯会带入较大误差，应先作空白检查，必要时，应用玻璃磨口蒸馏器蒸馏后再用。溶液中的悬浮物对光有散射作用，必 要时，应用垂熔玻璃滤器滤过或用离心法除去。所用的玻璃仪器与测定池等也必须保持 高度洁净。温度对荧光强度有较大的影响，测定时应控制温度一致。溶液中的溶氧有降 低荧光作用，必要时可在测定前通入惰性气体除氧。 1. 特点 （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级 检测下限：1×10-12g/ml 相对灵敏度：1ug/ml硫酸奎宁的硫酸溶液 （2）选择性强 发射光谱、吸收光谱 （3）试样量少 缺点：应用范围小 (1)定量依据 当荧光物质浓度很小时，荧光强度If与荧光物质浓度c之间的 关系式为 If=2.3φfI0εbC 式中：φf为荧光效率，I0为激发光的强度，ε荧光物质的摩尔吸收系数，b为试样池的光程，C为荧光物质的浓度。 在一定条件下，φf、I0、ε、b均为常数，所以上式可写成 If=KC 即荧光强度与荧光物质的浓度C成正比。 荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀的溶液。对于较浓溶液，会产生浓度猝灭现象。 标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度； 比例法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度 利血平片 拼音名：Lixueping Pian 英文名：Reserpine 【含量测定】 避光操作。 对照品溶液的制备：精密称取利血平对照品10mg，置100ml 棕色量瓶中，加氯仿10 ml溶解后，再用乙醇稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml ，置100ml 棕色量瓶中