双循环线性滚环扩增检测HBV 替诺福韦耐药位点的方法学研究.pdfVIP

第３５卷第１１期 第　三　军　医　大　学　学　报 Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．１１ ２０１３年６月１５日　　　　　　　　　　 Ｊ　Ｔｈｉｒｄ　Ｍｉｌ　Ｍｅｄ　Ｕｎｉｖ 　　　　　　　　　　 Ｊｕｎ．１５　２０１３ １０９３ 文章编号：１０００５４０４（２０１３）１１１０９３０４ 论著 双循环线性滚环扩增检测ＨＢＶ替诺福韦耐药位点的方法学研究 林钟劝，陈　瑶，韩　梅，夏　宇，姚　远，和昱晨，张　波　　（４０００３８重庆，第三军医大学西南医院全军检验医学专科中心） 　　［摘要］　目的　探讨双循环线性滚环扩增（ｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＲＣＡ）检测ＨＢＶ替诺福韦耐药基因突变位点的 可行性。方法　 以ＨＢＶ替诺福韦耐药基因突变位点为检测靶点，设计该位点的锁式探针以及包括该位点的ＨＢＶ野生 型、突变性模板。锁式探针与野生型模板特异识别并结合，通过Ｅ．ｃｏｌｉ连接酶连接为闭合环形结构，加入引物启动第 １轮 ＲＣＡ；扩增产物用Ｈｐａ 酶切游离出检测模板，重复上述过程进行第２轮ＲＣＡ，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；并对该方法 Ⅰ 的特异性、检测限及连接效率的影响因素进行初步探讨。结果　 探针与模板的杂交温度为４５℃时，探针的环化连接效率 最高、特异性最好。通过对不同浓度野生型模板的检测，单循环 ＲＣＡ的检测限为５０ｐｍｏｌ／Ｌ，双循环 ＲＣＡ的检测限为 ５ｐｍｏｌ／Ｌ，检测灵敏度提高了１０倍。结论　 初步建立了检测ＨＢＶ替诺福韦基因耐药位点突变的双循环ＲＣＡ方法。 　　［关键词］　 双循环滚环扩增；耐药位点；突变 　　［中图法分类号］　Ｒ３７３．２１；Ｒ３９４３３；Ｒ４４６．９　　 ［文献标志码］　Ａ ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｅｎｏｆｏｖｉｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｏｆＨＢＶｂｙｃｉｒｃｕｌａｒｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＬｉｎＺｈｏｎｇｑｕａｎ，ＣｈｅｎＹａｏ，ＨａｎＭｅｉ，ＸｉａＹｕ，ＹａｏＹｕａｎ，ＨｅＹｕｃｈｅｎ，ＺｈａｎｇＢｏ（ＣｅｎｔｅｒｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ＴｈｉｒｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，４０００３８，Ｃｈｉｎａ） 　　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　 Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｕｓｉｎｇｃｉｒｃｕｌａｒｒｏｌｌｉｎｇｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＲＣＡ）ｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｔｏｔｅｎｏｆｏｖｉｒｉｎｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓ（ＨＢＶ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　 Ｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｔｅｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｏｆＨＢＶｔｏｔｅｎｏｆｏｖｉｒｗａｓｔａｋｅｎａｓｔａｒｇｅｔｔｏｄｅｓｉｇｎｔｈｅｐａｄｌｏｃｋｐｒｏｂｅ．Ｗｉｌｄａｎｄｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｌａｔｅｓｗｅｒｅａｌｓｏｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｉｎｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｅｄｅｓｉｇｎｅｄｐａｄｌｏｃｋｐｒｏｂｅｓｗｅｒｅｌｉｎｋｅｄｔｏｃｌｏｓｅｄｒｉｎｇｓｂｙ Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡｌｉｇａｓｅｗｈｅｎｔｈｅｙｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｂｏｎｄｅｄｔｏｗｉｌｄｔｅｍｐｌａｔｅｓ．ＲＣＡｗａｓｓｔａｒｔｅｄｗｈｅｎｐｒｉｍｅｒｓａｎｎｅａｌｅｄｔｏ ｔｈｅｐｒｏｂｅｓ．ＴｈｅｎＨｐａ ｃｕｔｏｆｆｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｄｒａｓｔｉｃａｌｌｙ，ａｎｄｍｏｒｅｔｅｍｐｌａｔｅｓｗｅｒｅｒｅｌｅａｓｅｄ．Ｔｈｅｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｅｓ Ⅰ ａｂｏｖｅｗｅｒｅｒｅｐｅａｔｅｄｔｏｓｔａｒｔｔｈｅＲＣＡｆｏｒａｓｅｃｏｎｄｔｉｍｅ．Ｆｉｎａｌｌｙｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙ１％ ａｇａｒｏｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｔｉａｌｆａｃｔｏｒｓｏｆｌｉｇａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｗｅｒｅａｌｓｏｓｔｕｄｉｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅｌｉｇａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｐｒｏｂｅｗｅｒｅｅｎｈ