拟南芥Alpha-dioxygenase 2 (AtDOX2) 在毕赤酵母中的表达, 纯化及活性鉴定.pdfVIP

11 1 业生物技术学报，20 11 年，第19 卷，第1 期，第51~56 页 Journal of Agricultural Biotechnology, 201 1, Vol.19, No.1, 51~56 研究报告 A Letter 拟南芥Alpha-dioxygenase 2(AtDOX2)在毕赤酵母中的表达、纯化及 活性鉴定 魏少华1 1 1 1 1, 2 * 杨宇衡 安瑞 单丽伟 范三红 1 西北农林科技大学生命科学学院，杨凌712100；2 陕西省 业分子生物学重点实验室，杨凌712100 * 通讯作者，sanhong.fan@ 摘要 为了获得具有生物活性的拟南芥(A rabidops is thaliana) alpha-dioxygenase 2( AtDOX2) ，将其对应基 因A tDOX 编码区克隆到酵母表达载体pPIC9k 中，获得重组表达载体pPIC9k-A tDOX ，将线性化的重组载 体电击转化入毕赤酵母(Pic hia pastoris)表达菌株GS115，经G4 18 筛选、PCR 鉴定和甲醇诱导时间优化，获得 重组AtDOX2 的高效表达菌株GS115/pPIC9k-A tDOX2 。SDS分析结果显示，0.5% 甲醇诱导96 h 重组 蛋白表达量最高，其表达量占胞外总蛋白的15% 。重组AtDOX2 的表观分子量约为70 kD ，经Ni-NTA 柱亲 和层析可获得纯度大于80% 的重组蛋白。2,2 -Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)法测定 结果表明重组蛋白具有过氧化物酶活性，且其活性受Ca2+ 和Mg2+ 激活，受EDTA、咪唑和Mn2+ 抑制；2,4- 二 硝基苯肼(2,4-DNP)法测定结果显示，重组AtDOX2 具有双加氧酶活性，Ca2+ 对其双加氧酶活性也有激活作 用。结果说明利用酵母表达系统获得了具有活性的重组AtDOX2 ，AtDOX2 同时具有过氧化物酶活性和双加 氧酶活性。 关键词 拟南芥，AtDOX2 ，毕赤酵母，过氧化物酶，- 双加氧酶 Expression, Purification and Activity Identification of A rabidops is thaliana Alpha-dioxygenase 2 (AtDOX2)in Pic hia pastoris Wei Shaohua1 Yang Yuheng1 An Rui1 Shan Liwei1 Fan Sanhong1, 2 * 1 College of Life Sciences, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, China; 2 Key Laboratory of Agriculture Molecular Biology of Shaanxi Province, Yangling 712100, China * Corresponding author, sanhong.fan@ DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2011.01.007 Abstract In order to obtain active A rabidops is thaliana alpha-dioxygenase 2 (AtDOX2), the encoding sequence of A tDOX2 was cloned into pPIC9k to obtain pPIC9k-A tDOX2. The recombinant vector was linearized and elec- trophorated into Pic hia pastoris strain GS115. After G418 selection, PCR analysis and optimization of methanol inducing time the high level expression strain of GS115/pPIC9k-A tDOX2