生物材料中β-激动剂的测定方法综述.docVIP

生物材料中β－激动剂的测定方法综述 　　 常碧影 宋 荣 (国家饲料质检中心,北京) 　　(上接第17期) 　　2.样品提取与净化 　　样品预处理的目的是让其变成易于β－激动剂提取的形态。样品经粗提后，还要经过不同类型的净化处理，如常规的液液分配、固相萃取（SPE）、免疫亲和色谱和基质固相分散（MSPD）等。有些情况下可将这些方法联合应用，以得到较高纯度的提取液。 　　2.1溶剂萃取和液－液分配 　　溶剂萃取原本是从生物样品中溶解离析药品化合物的标准方法。然而，这种方法比较耗时，特别是提取极性化合物或具有不同化学性质的多种化合物时更是如此。至今提取β－激动剂的主流方法是先把样品pH调至该化合物的pKa值以上（通常 9.0），使之呈去质子状态, 然后用一种有机溶剂提取。大多数测定克伦特罗的方法都采用了这一方案。Diequet等曾研制了一种从小鼠血浆中提取克伦特罗的方法，该法在高pH下，将其提至氯仿中。虽然回收率很低（45％），但由于用了育亨宾硷作内标，使得测定的重现性达到了现有水平。Brunn用二氯甲烷做提取剂，使尿中的提取率提高到80％。后来又有人用乙醚从牛尿和大鼠脑组织中提取克伦特罗，这后一报道很有趣，他们的提取重点是较疏水的克伦特罗，却选用了极性更高的乙醚。人们一直报道说乙醚对于较亲水的化合物——沙丁胺醇是适宜的提取剂，但在笔者的实验室，用乙醚提取沙丁胺醇的效率却不很高。 　　Coutheyn等人说：在酸性条件下，可以更有效地从粪和饲料中提取苯胺型（如克伦特罗）、间苯二酚型（如特布他林）和苯酚型（如沙丁胺醇）等3种类型的β－激动剂。用稀盐酸同时加或不加有机溶剂（乙酸乙酯、甲醇）可使各种类型的β－激动剂均能得到高的提取效率，因为在酸性条件下，它们都处于同一状态——即脂肪链上的氨基呈正离子态，而芳香部分则不带电荷。有机溶剂的比例增加会提高β－激动剂的回收率，但不利的是被提出的杂质水平也会增加。为进一步净化，可将提取液调至碱性（pH 9.5～10.0），然后回提到异丁醇中。在pH 8以上用多种有机溶剂都能使克伦特罗得到高回收率，但沙丁胺醇和特布他林却只能在较窄???pH范围（9～10），用异丁醇提取才能达到(80％左右)。 　　液液分配可用做组织样品初提液的净化方法，也可将提取和净化结合起来，特别对于生理体液样品更是如此。Blanchflower等人将多次乙醚萃取和酸的回提结合起来，使克伦特罗提取液可直接用于GC－MS分析。Girault及其同事们测定了多种牛生物样品中的克伦特罗。他们在高pH值下，用乙酸乙酯提取已经预处理的样品，再将之回提到稀酸中，然后用乙酸乙酯－己烷（2＋1）溶液洗涤，最后再萃取到乙酸乙酯中。Foster等人应用了类似的方法，但以叔丁基甲醚（TBME）做主萃取剂。Furst等改进了样品净化方法，他们用二氯甲烷洗涤血浆样品，再用TBME萃取克伦特罗。其他一些人也曾报告了用这种溶剂萃取克伦特罗和更具亲水性的化合物非诺特罗的方法。但他们在萃取时将pH值调准至9.5, 以便使非诺特罗从其轭合物中解离出来。 　　有时，欲有效提取待分析化合物，需要多种有机溶剂。Horiba等在研究尿样马布特罗及其代谢物时，先将样品蒸发、脱盐，调节pH至10，用乙酸乙酯－丙酮（3＋1）溶液提取。然后再调节pH值，进一步用溶剂萃取，除去酸性和中性代谢产物。Loo等报告了血浆样品中沙丁胺醇的2次萃取方法。他们用乙酸甲酯选择性地将沙丁胺醇从主要的硫酸酯代谢物中提出，蒸发溶剂，用四氢呋喃－TBME混合溶液洗涤，然后将之萃取到碱性溶液中进行分析。他们用极性更大的混合溶剂，即添加一定比例（10％～30％）极性溶剂如丁醇，提高了沙丁胺醇的回收率。用（9＋1）的乙醚－2－丁醇或TBME－正丁醇混合液可使苯胺型β－激动剂的回收率高达90％以上。用类似比例的乙酸乙酯—正戊醇混合液可有效地从人尿和血清样品中提取非诺特罗。欲提取更宽范围的，即包括苯胺型和苯酚型的β－激动剂，需选用叔丁醇—乙酸乙酯（3＋7）混合溶剂。 　　另一种从生物基质中提取离子态化合物的方法是用离子对/液液分配法。用二（2－乙基己烷基）磷酸酯（DEHP）做离子对试剂可将沙丁胺醇从血浆样品提取到氯仿中，然后将其回提到稀酸中，做HPLC分析。该法也已被Wu等人采用，不过他们用了异丙喘宁内标。Tan和Soldin则先用C18初步固相萃取（SPE）净化后，再用DEHP和1－庚烷磺酸做离子对萃取将沙丁胺醇和内标非诺特罗提出，他们用的溶剂是乙酸乙酯，沙丁胺醇的回收率达80％。Miller和Greenblatt提出了一种更快速的方法，也是基于DEHP－乙酸乙酯萃取。最近，Sagar等人报道了在这个领域的工作，他们用离子对试剂十二烷基硫酸钠和乙酸乙酯从人血浆中提取了沙丁胺醇（回收率90％）。