多巴胺诱导PC12细胞凋亡的免疫组织化学及超微结构分析.docVIP

多巴胺诱导PC12细胞凋亡的免疫组织化学及超微结构分析 作者：李立宏　高国栋　王学廉　张宝国 【关键词】 超微结构 　　关键词: 超微结构;PC12细胞;凋亡;帕金森病;多巴胺 　　摘 要:目的 研究帕金森病（PD）多巴胺能神经元的死亡机制. 方法 在免疫组织化学基础上，采用流式细胞仪、电泳及电镜技术观察不同浓度多巴胺（DA）诱导大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡的超微结构及生化改变. 结果 适当浓度DA可诱导PC12细胞凋亡.早期表现为线粒体结构及功能的改变并有抗凋亡蛋白bcl-2的表达，后期电镜下可见凋亡特征性核结构改变及典型的DNA“阶梯状”电泳带. 结论 细胞凋亡参与了PD的病变过程，线粒体在早期细胞凋亡中起着重要的调节作用. 　　Keywords: ultrastructure; PC12 cells; apoptosis;Parkinson’s disease;dopamine 　　Abstract:AIM To study the mechanism of dopaminergic neuronal death of Parkinson’s diseases（PD）.METHODS Using the flow cytometry，electron microscope，elec-trophoresis and the immunohistochemistry technology，we observed the alteration of ultrastructure and biochemistry of the apoptosis on PC12cells induced by dopamine with differ-ent concentration.RESULTS Moderate concentrations of dopamine（DA）induced apoptosis in PC12cell.The early al-teration was that of structure and function of mitochondrion and the expression of bcl-2anti-apoptosis protein.Then the specific nuclear ultrastructure of apoptosis and the typical　DNA“ladder”electrochromatography were found.CON┐CLUSION Apoptosis may be involved in the pathogenesis of PD，and the mitochodria plays a significant role in the early apoptosis of cells. 　　0 引言 　　帕金森病的特征性病理改变为黑质-纹状体多巴胺能神经元进行性死亡、缺失.其具体机制迄今尚不完全明确，目前认为PD患者脑内氧化应激反应过强，导致脑内神经递质多巴胺异常代谢产生过量的反应性氧自由基在其中起重要作用［1］ .细胞凋亡是致病因子或异常信号诱导发生的“生理性”的主动细胞死亡过程.它可能参与了PD的发病过程［2，3］ .PC12细胞株做为一种儿茶酚胺类细胞株，被广泛应用于神经细胞死亡方式及毒性损害研究.我们主要观察多巴胺（DA）诱导PC12细胞凋亡的早期超微结构变化，以探讨细胞凋亡在PD的发病机制中的作用. 　　1 材料和方法 　　1.1 细胞培养 PC12细胞株（购于中国科学院上海细胞生物研究所）置于RPMI-1640培养液中，内含200mL#12539;L-1 胎牛血清，谷氨酰胺2mmol#12539;L-1 ，青霉素50ku#12539;L-1 ，链霉素25mg#12539;L-1 ，培养瓶中预先铺以200mg#12539;L -1 鼠尾胶，用于细胞传代，置于50mL#12539;L-1 CO2 孵箱37℃培养，隔天换液. 　　1.2 药物处理 待PC12细胞生长良好时加入多巴胺0.5mmol#12539;L-1 ，同时将部分细胞置于培养皿中，进行细胞爬片.空白对照组加入RPMI-1640培养液.分别培养12及24h. 　　1.3 形态学观察 分别取0.5mmol#12539;L-1 多巴胺培养12h及24h的细胞片，福尔马林固定30min，0.01mmol#12539;L -1 PBS缓冲液洗涤3次，每次5min，HE染色光镜下观察