工艺原理（五)_1.pptVIP

第二节 好氧发酵产物积累机制 好氧性发酵(aerobic fermentation)： 在发酵过程中需要不断地通入一定量的无菌空气， 如：利用黑曲霉进行柠檬酸的发酵、 利用棒状杆菌进行谷氨酸的发酵、 利用黄单孢菌进黄原胶－多糖的发酵等等． 糖的分解代谢包括糖酵解（糖的共同分解途径）和三羧酸环（糖的最后氧化途径）。 （1） 糖酵解及丙酮酸代谢的调节 第一个调节的酶是磷酸果糖激酶(PFK)： AMP、无机磷、NH4+对该酶有活化作用 ATP、柠檬酸对该酶有抑制作用 PFK是一种调节酶，其活性受柠檬酸的强烈抑制，必须解除。 微生物体内的NH4+,可以解除柠檬酸对PFK的反馈抑制作用，在较高的NH4+,浓度下，细胞可以大量形成柠檬酸。 柠檬酸生产菌—黑曲霉如果生长在Mn2+缺乏的培养基中，蛋白质的合成受阻，导致细胞内NH4+浓度足够高，可达到26mmol/L,从而解除了柠檬酸对对PFK的反馈抑制，使得葡萄糖源源不断地合成大量的柠檬酸。 　 （2） TCA环的调节 柠檬酸合成酶是该途径的第一个限速酶，由乙酰辅酶Ａ中的高能硫酯键水解释放大量能量，推动合成柠檬酸。 　　柠檬酸　　　顺乌头酸　　　异柠檬酸 两步反应均由顺乌头酸酶催化，该酶需要Fe2+，若用络合剂除去反应液中的铁，则酶活性被抑制，造成柠檬酸的积累。 顺乌头酸水合酶在催化时建立如下平衡 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸＝90 ：3：7　 　　黑曲霉中TCA循环中的另一个特点是?－酮戊二酸脱氢酶被葡萄糖和NH4+抑制，在柠檬酸生成期，菌体内不存在?－酮戊二酸脱氢酶或活力很低。 能荷调节 柠檬酸产生菌可以在有氧的条件下大量生成柠檬酸，也就是说，NADH即被氧化了，又没有产生ATP，为什么？ 能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP，用于菌体自身的生长，这种现象，在生产上通常称之为只长菌不产酸，大量的葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸。 能荷调节对柠檬酸发酵的影响 设想：该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD(P)H经过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP。 大量的实验证明，在柠檬酸发酵的黑曲霉中，确实存在一条这样的侧系呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧。 如果在柠檬酸的发酵过程中，发酵液的溶氧浓度在很低的水平维持一段时间，或者在这期间中断供氧一段时间，则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果产生了大量的菌体，而柠檬酸的产率很低。 柠檬酸发酵需要下述环境条件： 磷酸盐浓度低；氮源为NH4+盐； pH值低（低于2.0）； 溶氧量高；Mn2+ 、 Fe2+ 、 Zn2+含量极低。 　　柠檬酸发酵中黑曲霉对Mn2+极端敏感。黑曲霉在缺锰的条件下发酵 ，细胞有生理和代谢的变化，微生物体内的NH4+ 水平高，细胞可以大量形成柠檬酸。 　　Mn2+的效应可以认为是NH4+水平升高而减弱了柠檬酸对EMP途径关键酶（PFK）的抑制。 　 由于TCA循环降低，ATP的生成减少，蛋白质和核酸合成受阻，细胞内的NH4+异常高，从而降低了柠檬酸对PFK的抑制。 柠檬酸发酵的控制关键： EMP 畅通无阻：控制锰离子，提高胞内NH4+ 浓度，解除柠檬酸对PFK的抑制，控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。 阻断柠檬酸向下的代谢：阻断顺乌头酸酶的催化作用，该酶是个含铁的非血红蛋白，以Fe4S4作为辅基。因此，在菌体生长到足够菌数时，适量加入亚铁氰化钾（黄血盐），使与铁硫中心的Fe2+ 生成络合物，则该酶失活或活性减少，而积累柠檬酸。通过诱变造成生产菌种顺乌头酸酶的缺损或活力很低，同样积累柠檬酸。 保证C4二羧酸的及时补充 固定CO2 　　 外加草酰乙酸　 选育回补途径旺盛的菌种。 柠檬酸发酵的产率 葡萄糖经过EMP途经生成丙酮酸后，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的作用下生成了乙酰辅酶A(CH3CO-COA)，则合成一分子柠檬酸需要3分子的CH3CO-COA，也就是需要1.5分子的葡萄糖，此时，柠檬酸的产率： 通过 CO2固定反应提供C4二羧酸 丙酮酸固定CO2生成一分子的C4二羧酸，那么合成一分子的柠檬酸需要1分子的葡萄糖，产率可以大大的提高。可见，CO2固定反应堆与柠檬酸发酵的重要性。