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应用肽核酸（PNAs ）探针检测疾病相关的特异性突变 Roberto Gambari Biotechnology Center, Ferrara University, Ferrara, Italy. 摘要 我们报告了应用 Biacore 的 SPR 技术以肽核酸（PNAs）作为探针识别由 PCR 扩增得到 的目标 DNA 中存在的 W1282X 囊性纤维化点突变。实验结果表明应用 Biacore 系统以肽核酸 探针进行人类遗传疾病的诊断是完全可行的。 我们计划应用Biacore 的SPR 技术实时监 生物素的PCR 产物（包 控DNA 杂交的整个过程，用以检测HIV-1 感 括正常的（N- 染（1），转基因生物（2 ）和囊性纤维化跨膜 W1282X/N-W1282X ）， 传导调节(CFTR)基因的点突变Δ508 （3 ）和 杂合的（N-W1282X/M- Fig1 W1282X （4 ）。在这项究中，我们特别关注糖 W1282X ）以及纯和的 实验方案：A 组， 磷酸化骨架在N 端被2 个单元的氨基乙取代的 （M-W1282X/M- 标记了生物素的正 常目标ODNs 或携 肽核酸。用肽核酸与互补DNA 链杂交的效率 W1282X ））被分别耦连 带CF W1282X 突变 很高，产生沃森-克里克（Watson-Crick ）型双 到不同的传感片通道表 的ODNs 被分别耦 链结构，它基本不受目标DNA 中存在的人为 面（Fig1B ）。在这两种 连在不同的两个通 结构的影响（5 ）。肽核酸也被认为与单链的 方案中PNA 探针和DNA 道上。B 组，目标 DNA 是由抽提自正 PCR 产物结合能力比寡脱氧核苷酸（ODN ）强 探针被加到传感片表面 常样品，杂合 （6 ），因此能更好地检测到点突变。应用 观察它们与目标DNA 的 W1282X 样品和纯 Biacore 的SPR 技术我们发现15-20 个核苷酸长 作用。 合W1282X 样品的 度的ODN 的杂交效率较高，但是无法区别完 模板DNA 经PCR 扩增得到的，扩增 全匹配和部分不匹配的情况；而短一些的 PNA 探针结合的特异性 引物用生物素标 ODN 探针在能区分出有点突变的DNA 的同时 和高效性 记。将这些PCR 产 结合效率也变差了。相反地，即使是很短的 物目标DNA 耦连到 PNA 探针与目标DNA 的杂交效率也很高，因 9-mer PNA 探针 不同的通道。N- 为PNA:DNA 杂交链的解链温度较DNA:DNA （Fig2A,2B ）与9-mer W1282X 探针序列 为5’-TCCTCCACT- 杂交链高（5 ），这是由于肽核酸是不带负电 DNA 探针相比较(Fig2C, 3’(DNA)和H- 荷的。 2D) ：另人惊奇的是，N- TCCTCCACT-NH2 我们最近报道了应用Biacore 系统检测到 W1282X 和M-W1282X （PNA ），M- W1282X 探针的序 CFTR 基因的色氨酸1282-TER 突变（6 ）。 只与完全互补的目标 列为5’- Biacore1000 分析系统，SA 传感片，表面已包 DNA 杂交，其杂交效率 TCCTTCACT- 被了链霉抗生物素(Streptavidin)，持续流动缓 比DNA 探针高很多，且 3’(DNA)和H- 冲液HEPES