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DGGE、RFLP分析脱色活性黑5混合菌群FF群落结构 摘 要：通过DGGE对确定混合菌群FF微生物群落结构信息 关 键 词： 中图分类号：X 文献标识码：A 微生物是生物法处理偶氮染料废水的作用主体，通过微生物新陈代谢作用产生的酶，不断降解和矿化染料，在废水处理系统中起重要作用。然而，微生物种群结构和多样性的变化，会增加生物处理的难度。因此，以分子生物学技术为基础，研究废水处理系统中微生物群落组成、结构与功能、代谢活性等，了解微生物种群活动及其相互关系，以及微生物群落结构与废水生物处理效率的关联性，用于指导生物处理的理性设计和过程调控是废水微生物处理技术的重要研究方向，并且对提高微生物降解有机有毒污染物能力、提高偶氮染料废水处理效率具有重大意义。 目前，用于微生物生态研究的分子技术有DGGE、RADP、RFLP、TGGE、FISH、克隆文库、基因芯片等[]。其中RFLP和DGGE在各种微生物生态系统研究中应用的最广泛。聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术是直接利用微生物的遗传特性(DNA及RNA)进行表征的，因此研究者能够动态的评价微生物种群动态性和复杂微生物群落结构演替规律[]。目前，PCR-DGGE技术被认为是检测微生物群落结构最为有效的手段之一[]，并且该技术有非常明显的优越性在研究自然界微生物群落结构等方面，而对16S rDNA PCR产物进行限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析，亦是获得细菌基因型信息的有效手段[]，RFLP非常适合用于种内和分类很接近的种间水平上的研究[]。 王颖[]采用分子生物学技术DGGE和454高通量测序技术来分析固态醌介体强化偶氮染料厌氧生物脱色体系中微生物群落结构及动态变化，结果表明Halomonas sp.在醌基陶粒介导偶氮染料厌氧生物脱色中发挥主要作用，并且两种方法得到主要菌落信息一致。 张松柏等[]从农药厂废水中分离到能够降解多种拟除虫菊酯的复合菌群JZ-1，并对该菌群的16S rDNA进行扩增和RFLP及测序，RFLP分析发现该文库的库容C为93.54%，Shannon-Wiener多样性指数H为1.20。说明该菌群含有丰富的细菌资源，该菌群的优势种群包括红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)和紫单孢菌科细菌(Porphyromonadaceaebacterium)。 混合菌群FF是一个复杂的微生态系统，系统内多种微生物的协同作用，对染料废水的处理起着非常重要的作用。因此，本文利用16S rDNA 及变性梯度凝胶电泳（DGGE）、限制性片段长度多态性分析（RFLP）的方法对脱色降解活性黑5的混合菌群FF群落结构进行解析，初步研究混合菌群FF的微生态系统，以期为染料废水处理机理研究及优化废水处理过程提供更多的理论基础。 1.1 材料 1.1.1 试验样品 本实验室驯化筛选得到的对活性黑5具有高效脱色性能的混合菌群FF。 1.1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，氯化钠5.0，pH调整至8.0±0.2。 LB培养基(g/L)：Yeast extract (酵母提取物)5.0，Typtone(胰蛋白胨)10.0，NaCl (氯化钠)5.0，pH调整至7.4±0.2。 平板培养基：在培养基中加入1.5%的琼脂，然后在培养皿中倒平板。 以上培养基均在1×105 Pa灭菌20 min后冷却备用。 1.1.3使用仪器 YXQ-LS-30S II型压力蒸汽灭菌锅(上海博讯)；BIO-RAD DcodeTM变性梯度凝聚电泳仪(美国伯乐公司)；T-Gradient Thermoblock Biometra PCR扩增仪(Germany)；DYY-III 2 型稳压稳流电泳仪(宁波天恒仪器厂)；Gel DocTM XR+型BIORAD凝胶成像系统(美国BIO-RAD)；Thermo Legend Micro 17 离心机(美国THERMO) 1.2 方法 1.2.1 混合菌群FF基因组DNA提取及16S rDNA PCR扩增 取1 mL培养至对数期混合菌群FF菌液使用上海生工生物技术有限公司Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒 (EZ-10Span column Genomic DNA Isolation Kit)提取DNA。将提取的DNA样品采用NanoPhotometerTM(Implen GmbH, Munich, Germany)微量核酸蛋白分析仪测定提取液中双链DNA的浓度和260/OD280比值。然后用细菌通用引物对(正向引物27F 5’-AGAGTTYGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物1492R 5’-AAGG