GB/T 27765-2011SiO2、TiO2、Fe3O4及Al2O3纳米颗粒生物效应的透射电子显微镜检测方法.pdf

..雷雪 中华人民共和国国家标准./ 、、及纳米颗粒 生物效应的透射电子显微镜检测方法 ,, 发布 ?实施 宰瞀髁鬻瓣警糌瞥星发布 中国国家标准化管理委员会促”标准分享网 免费下载 刖 昌 /本标准按照/ .?给出的规则起草。 本标准由全国纳米技术标准化技术委员会/ 提出并归口。 本标准负责起草单位:中国人民解放军第二军医大学、复旦大学及地科院矿产资源研究所。 本标准主要起草人:杨勇骥、俞彰、周健雄、张天宝。标准分享网 免费下载 范围 、、及纳米颗粒 生物效应的透射电子显微镜检测方法 /本标准规定了透射电子显微镜检测含有:、:、。。及:。纳米颗粒材料的生物试样的 技术和规范。 本标准适用于、。、及纳米颗粒材料的生物效应透射电镜检测的生物薄试样 超微结构分析。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本包括所有的修改单适用于本文件。 /生物薄试样的透射电子显微镜一射线能谱定量分析通则 /纳米材料术语 /:检测和校准实验室认可准则“ 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 .纳米颗粒 纳米尺度的固体粒子。本标准中出现的纳米颗粒材料特指为:、。、。。及:。纳米颗 粒材料。 .生物效应 纳米材料与生命过程的相互作用产生的生理功能、生化功能及形态结构的变化。 .生物效应检测 采用生物学、化学、毒理学与医学等领域的实验技术进行检验测量。 .生物薄试样 生物薄试样是指采用超薄切片机切成的、厚度为 ~的生物试样,用于透射电镜观察。 基本原理 纳米颗粒材料的表面理化特性使其易形成团聚,经分散后与生物体接触。纳米颗粒材料与生物体 接触后,需采用超微结构制样方法,将其制成生物薄试样,在透射电镜下检测纳米颗粒材料作用于生物 标准分享网 免费下载 /体后产生的细胞及细胞器的超微结构变化,以确定纳米颗粒材料对生物体的生物效应作用。用聚焦的 高能电子柬照射生物薄试样的微小区域,入射的电子束大部分透过薄试样,形成透射电子,透射电子中 含有大量携带有生物薄试样内部信息的非弹性散射电子,非弹性散射电子在荧光屏、照相底片或 上成像,形成生物薄试样的超微结构图像。 仪器设备和材料 .仪器设备 ..透射电子显微镜。 ..超薄切片机。 ..制刀机。 ..玻璃刀或钻石刀。 ..恒温烘箱℃~℃。 ..超声波清洗仪。 .材料 ..戊二醛。 ..四氧化锇。 ..乙醇。 ..丙酮。 ..环氧树脂。 ..醋酸双氧铀。 ..构橼酸铅。 仪器的环境条件 超薄切片机、透射电子显微镜的工作环境应符合以下要求: .超薄切片机 ..切片室应为超薄切片专用房间。 ..相对湿度小于%。 ..温度:士℃。 ..电源电压:士%。 .透射电子显微镜 .. 电镜室应为电镜专用房间。 ..相对湿度小于%。 ..温度:土℃。 ..杂散电磁场干扰应小于. 。..电源电压及频率应稳定士%, 士。..具备仪器专用地线,接地电阻应小于 。标准分享网 免费下载 纳米颗粒材料分散 /.将纳米颗粒材料与溶剂按一定的比例充分混和。 .放人超声波清洗仪中分散。 注:建议分散的条件:水温~℃;功率 ;频率士%;时间 左右。 生物薄试样制备 .纳米颗粒材料 ..将不同浓度、已分散的纳米颗粒悬液滴在有支持膜一般用火棉胶或膜的≠ 透射电镜专用载网上。 ..将滴有纳米颗粒材料悬液的电镜专用载网放入恒温烘箱中,℃烘烤 。.生物组织 ..取材:将生物组织在~%戊二醛固定液℃中迅速切成小于 的小块。配制戊二 醛固定液可参考附录。 ..前固定:将小块组织浸泡在倍体积、℃的~%戊二醛固定液中固定~,用缓冲液 充分漂洗。 ..后固定:将生物小块组织浸泡在%锇酸,℃固定 。配制锇酸可参考附录。 ..脱水:用乙醇或丙酮梯度脱水。建议乙醇或丙酮梯度脱水的顺序为:%、%、%、%乙醇 各一次;%丙酮次,%丙酮次;每次~。 ..包埋:在按比例配制好的环氧树脂以为例,配制比例可参考附录中浸透后,在胶囊 或硅胶包埋板内进行包埋。建议浸透比例为,丙酮:包埋剂浸透时间:,~;; 纯包埋剂 。..聚合:在恒温烘箱内进行聚合,℃聚合 后,升温至℃聚合~。 ..修块:包埋块在进行超薄切片之前,将分析部位修成易于超薄切片的形状。 ..超薄切片:采用超薄切片机将已修好的包埋块切成超薄切片,厚度一般要求在~。 ..染色:采用醋酸铀和枸橼酸铅对超薄切片进行双重金属染色后待检。 .培养细胞 ..前固定:用橡皮刮将细胞从培养皿底部刮下或胰酶消化下来,低速离心 ,成小团 块,弃上清,沿管壁加入~%戊二醛固定液,放人℃冰箱固定~。用缓冲液充分漂洗。 ..后固定:经戊二醛固定的细胞团块用缓冲渡轻轻漂洗后,加入%锇酸,放人℃冰箱固定 。..脱水同..。 ..包埋同..。 ..聚合同.