利用免疫学方法研究Rubisco及Rubisco活化酶（中期考核报.pdfVIP

Rubisco定量技术 Rubisco定量技术 —— 免疫扩散法 —— 免疫扩散法 Rubisco （核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶）是光合 Rubisco （核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶）是光合 碳代谢中的关键酶，一方面催化光合作用中CO 固定的第一 碳代谢中的关键酶，一方面催化光合作用中CO22固定的第一 步反应，同时又催化光呼吸过程的第一步反应，调节着光 步反应，同时又催化光呼吸过程的第一步反应，调节着光 合作用和光呼吸的代谢比例，对光合速率起着决定性作用。 合作用和光呼吸的代谢比例，对光合速率起着决定性作用。 其含量常作为光合生理生化指标。 其含量常作为光合生理生化指标。 （一）实验原理 当琼脂胶上交联有某一蛋白（抗原）的 抗血清（抗体）时，只有该抗原才能与抗体 形成沉淀线，而一定范围内形成沉淀线的圆 面积与抗原量成正比。当把其它蛋白冲洗干 净后，用考马斯亮蓝R25染色，则可测出沉 淀线包围的圆面积，依此再利用标准样品可 计算待测样品中该蛋白的含量。 （二）方法步骤 1. Rubisco 的提取 取鲜叶0.100g （如果计算单位面积 酶活力则应测出叶面积）加液N2 固定， 并迅速磨成粉状，加1%不溶性PVP和 1ml~2ml Rubisco抽提液，磨成均浆，在 15 000g高速离心15min，上清液即为酶 粗提液，整个过程应在0℃~4 ℃下进行。 2. 制胶 根据样品多少计算胶用量（长×宽×厚）， 制作浓度为1%的琼脂胶。加热溶解后先用1%的热 琼脂液把塑料框固定在玻璃上，把内框多余琼脂用 水真空泵吸去。 待琼脂胶刚好冷却到55℃时加入适量抗血清 （抗血清用量为4µl/ml琼脂胶），迅速混匀后倒入 塑料框内，待胶凝固后打孔。 •3. 打孔点样 • 用微打孔器（Φ2mm) 按1.1cm×1.1cm孔 距均匀打孔，并用水真空泵吸去孔中琼脂胶， 然后分别在每个孔中注入标样和Rubisco粗提液 2µl ，重复4 次以上。将胶板放入装有用水吸饱 的数层滤纸搪瓷盘中，加盖置于25 ℃恒温箱中 48h 。 • 4. 染色脱色测定 • 取出胶板并浸入含0.9%NaCl 的塑料盘中轻 轻搅拌30min ，以去除其它杂蛋白，再用蒸馏 水冲洗数次后去掉塑料框架。胶上覆3层滤纸 及20层~30层吸水面巾纸，上压约1kg重量书一 本，30min后去除书及纸，用电热吹风机均匀 吹干胶至透明，再浸入染色液中染至蓝色（约 10min~20min），取出后用蒸馏水冲洗数次， 浸入脱色液中脱色，直至留下清晰的沉淀圆而 其它部分无色，再用电热吹风器吹干。 • 分别测出标样和待测样品圆面积，用标样浓度 和面积制作标准曲线，并根据待测样品面积， 计算样品Rubisco含量。 • 5、结果计算 • Rubisco含量的计算公式如下： 提取样品总体积(ml) Rubisco含量=标准曲线查得的× （mg/g.FW ） (mg/ml) 取样叶片鲜重(g) 图1 免疫扩散法测定酶含量示意图 图1 免疫扩散法测定酶含量示意图 （4）染色与脱色 表 1 Rubisco 和 Rubisco 活化酶的免疫扩散沉淀圈面积和含量关系的统计分析 Rubisco 1 号胶 2 号胶 Rubisco 1 号胶 2 号胶 含量 沉淀圈面积 活化酶含量 沉淀圈面积 contents Gel 1 Gel 2 Activase content Gel 1 Gel 2 (mg/ml) Precipitation areas(cm2)