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Na2CO3胁迫对星星草幼苗叶绿体GST活性的影响 姓名:汪月霞 学好:03238 指导教师：孙国荣 扬州大学农学院，扬州225009 土壤盐碱化已成为世界农业生产面临的主要威胁之一。全世界约有57亿亩土地具有不同程度的盐碱化[1，2]，我国15亿亩耕地中就有1亿多亩盐碱地，此外还有5亿多亩的盐碱荒地[3]。由于气候干旱、过度放牧与不合理利用等原因，造成土壤盐渍化程度加重，碱斑面积逐年扩大，草地生产力严重下降。治理碱斑，改良碱化草地，开发利用盐碱土地资源已是迫在眉睫。改良利用盐碱地的途径有很多，现在普遍认为筛选利用耐盐植物种和品种的生物措施是比较经济有效的方法。星星草是一种耐盐碱性较强的禾本科牧草，今年来被筛选经人工种植用于改良碱化草地效果良好，在黑龙江等地有一定面积的应用[4，5]，但有关星星草在盐碱胁迫下的反应和星星草对盐碱胁迫的抗性甚少。一般认为禾本科牧草在发芽期和苗期对盐份最为敏感[6，7]，而且有关研究较多[6，7，8，9，10]。但这些研究多是以中性盐NaCl作为胁迫处理的，对碱性盐涉及甚少，而星星草应用最多的松嫩草地的盐碱土就是以Na2CO3和NaHCO3为主要成分的。-SH基的非蛋白分子。在GST的催化下很容易与这些亲电子剂螯合。有些活性很高的亲电子剂可以直接与GSH螯合而不需要GST的催化。亲电子剂与GSH螯合后便被灭活。现已证实GST广泛存在于细菌、真菌、动物和植物体内[15]。除草剂及其类似物、机械损伤、氧化胁迫、高温等外界逆境可以诱导GST的合成[16]。因此我们以星星草幼苗为原料，用碱性盐溶液处理，通过不同浓度Na2CO3胁迫下星星草幼苗培养基质和叶片渗透势、叶片相对电导率、叶绿体GST活性和O2-测定不同浓度Na2CO3胁迫对星星草幼苗叶绿体GST活性的影响揭示星星草幼苗抗的机制。1.材料与方法 1．1 1．2 用容积为600ml的塑料盆装满珍珠岩，加住Hoagland培养液至珍珠岩表面湿润，然后将星星草种子均匀撒在其上，正常室温培养。 1. 3 材料处理 待幼苗长到二叶期以上（50d）进行盐胁迫处理。将幼苗随机分成6组（每组2个平行样），根据塑料盆所盛溶液数量（600ml）计算所需母液数量（10% Na2CO3），用漏斗加至珍珠岩底层，并补充相应数量的Hoagland液达到原湿程度，使6组塑料盆中Na2CO3浓度分别为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0g·100mL-1。 1． 测定方法 1．4．1 培养基质和叶片渗透势的测定7d后，采用5520型蒸压计渗压计（Hansatech公司）来测定培养基质和星星草叶片的渗透势。培养基质渗透势与Na2CO3浓度呈显著非线性关系（Y=-1.9588-4.3607X-0.0258X2，P=0.0021）（图1）。 1．4．2 叶绿体的分离与纯化 称取叶子5g，放入预先冷冻的研钵中（加入液氮），加入20ml的研磨液 molL-1蔗糖，50m molL-1磷酸缓冲液，10m molL-1KCl，10m molL-1MgCl2，10m molL-1EDTA，10m molL-1DTT），快速研磨；然后通过4层纱布过滤，并且在1000r下离心5min，弃沉淀； 滤液在3000r下离心5min，弃上清；沉淀被轻轻悬浮在5ml的悬浮介质中 ，并在3000r下离心5min，弃上清，沉淀即为叶绿体。 1．4．3 粗酶液的制备叶绿体用悬浮液洗2次后被悬浮在5ml的悬浮液 molL-1蔗糖，2.5m molL-1pH7.2磷酸缓冲液，10m molL-1EDTA，10m molL-1DTT）中加入0.05%Triton-100并15000r离心10min去除不溶物质，上清即为粗酶液。 1．4．4 molL-1 NaCl溶液和5ml蛋白质测定试剂，摇匀，测定OD595，用牛血清蛋白（BSA）同步制作标准曲线，根据测定的OD595值查标准曲线，计算蛋白含量，单位用mg·ml-1表示。 1．4．5 叶绿体GST活性的测定 3ml的反应体系包括1.5ml 50m molL-1pH=7.0磷酸，0.3ml 1m molL-1 GSH，0.3ml 1m molL-1 CDNB，以及0.1ml酶液，在25℃下，通过加CDNB底物来启动，不加CDNB反应对照， 分光光度计测量在340nm下1min OD340的变化值。1．4．6 叶片相对电导率的测定1．4．叶绿体O2-.的测定molL-1的盐酸羟胺，在25℃混合保温20mins，取保温液1ml依次加入1ml 17m molL-1的对羟基苯磺酸和1ml 7m molL-1的а-萘胺，在25℃反应20min，反应后的显色液与同体积正丁醇充分摇匀，静止分层后，取正丁醇相测A530，用磷酸缓冲液代替样品后作空白，单位是△A530·