基于蛋白质反式剪接的双载体凝血Ⅷ基因转移.pdfVIP

中国科学 C 辑 :生命科学 2009 年 第 39 卷 第 8 期 : 746 ~ 754 SCIENCE IN CHINA PRESS 基于蛋白质反式剪接的双载体凝血因子 基因转移 ① ① ① ① ② 朱甫祥 , 刘泽隆 , 迟晓艳 , 屈慧鸽 , 刘相钦 ① 鲁东大学生命科学学院, 烟台 264025; ② Department of Biochemistry and Molecular Biology, Medical College of Dalhousie University, Halifax B3H 4H7, Canada E-mail: fuxiangmail@163.com 收稿日期: 2009-04-10; 接受日期: 2009-07-02 山东省自然科学基金(批准号: Y2005D14)、烟台市科技计划(批准号: 2008152)、教育部留学回国人员科研启动基金和鲁东大学科研启动 经费资助项目 摘要 以intein 的蛋白反式剪接为工具, 研究了运用双载体的真核细胞凝血因子(F ) 关键词 基因转移, 通过翻译后剪接得到完整的功能性 F 蛋白. 将 B 结构域大部分缺失(Δ761~ intein 蛋白质反式剪接 1639)的人功能性F (BDD-F ) cDNA 于剪接所需保守残基 Ser1657 前断裂为重链和轻链, 凝血因子 分别与106 和48 个氨基酸的mini Ssp DnaB intein 的N 端(IntN)和C 端(IntC)编码序列融合, 双载体基因转移 构建一对在质粒 pcDNA3.1 的强启动子CMV 驱动下的真核表达载体. 用脂质体共转染至 293 细胞和COS-7 细胞, 培养48 h 后, 收集细胞上清, 用ELISA 检测培养上清中剪接形成 的BDD-F 蛋白水平, 用Coatest 法检测上清的功能性F 生物活性, 并用Western blot 观 察细胞内的 BDD-F 蛋白质剪接. 结果显示, 两种细胞培养上清中有较高水平的剪接 BDD-F 蛋白形成, 分别达到(137±23)和(109±22) ng/mL, 由细胞内和细胞外(培养上清) 的 剪接共同组成; 并检测到培养上清中较高水平的 F 生物活性, 分别为(1.05±0.16) 和 (0.79±0.23) IU/mL, 包括细胞内、外剪接产物 BDD-F 共同形成; 细胞总蛋白的 Western blot 进一步显示共转染后细胞内高效剪接形成的BDD-F 蛋白. 表明 intein 可用于双载体 系统真核细胞 F 基因转移, 并不完全依赖细胞内的剪接产生具有高 F 生物活性的 BDD-F 蛋白, 为进一步在甲型血友病基因治疗研究中应用双腺相关病毒载体(AAV)转运 F 基因, 克服AAV 载体的容量限制提供了依据. 蛋白质剪接作用是一种包埋于前体蛋白中的 主蛋白(N-extein, C-extein) 的肽键连接, 成为具有生 intein 多肽序列所介导的类似于 RNA 剪接的翻译后 物学功能的成熟蛋白质[1]. 蛋白质剪接分为顺式(cis) 蛋白质连接反应, 主要发现于原核生物和单细胞真 和反式(trans)两种, 分别由连续的 intein 和断裂的 核生物的某些宿主蛋白, 在翻译后的蛋白质成熟过 intein 介导, 大多数属于前者. Ssp DnaE intein 是第一 程中通过自催化剪接反应被切除, 同时伴随两侧宿 个被发现的天然反式剪接 intein, 存在于 Synechocystis 引用格式: 朱甫祥, 刘泽隆, 迟晓艳, 等. 基于蛋白质反式剪接的双载体凝血因子