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不同有机溶剂中生防菌JK-2活性物质的GC/MSD分析( 车建美，陈铮，刘波*，福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室 福州 350002 摘要： 关键词： 5%，表明还有成千上万的微生物种类有待进一步开发（Leslie A A）。由于不同的生态环境下微生物的种类和数量各不相同，因而就会产生不同种类和不同功能的次级代谢物（吴剑波）。拮抗微生物在代谢活动中通过分泌抗菌物质直接对病原物产生抑制是自然界普遍存在的现象，也是众多拮抗微生物应用的物质基础（于淑池）TLC法系统预试结果表明，其主要成分为挥发油、黄酮、萜类、甾体及其苷类、酚性成分、内酯及香豆素和有机酸类。魏鸿刚等发现青枯病生防菌菌株HY96发酵液的粗提物可能是分子量低于5kD的混合物，该混合物对青枯雷尔氏菌具有很好的拮抗作用。 短短芽孢杆菌是一类革兰氏染色阳性或可变、菌体杆状、以周生鞭毛运动、产芽孢的一类细菌。据报道，短短芽孢杆菌产生的短杆菌素一般由九种核糖体产生的线状短杆菌肽（gramicidins）和二十八种以上非核糖体产生的短杆菌酪肽（tyrocidines）和tryptocidines组成这些蛋白往往具有不同的生物活性Rautenbach等Edwards等。生防菌JK-2（短短芽孢杆菌JK-2，Brevibacillus brevis JK-2），系本实验室从发生枯萎病的田块分离得到的一株拮抗菌株，该菌株对不同病原菌均具有较强的抑制作用（郑雪芳；郝晓娟；陈璐；葛慈斌）。在前期的研究中，我们发现JK-2菌株至少可产生2种不同的活性物质，即分子量约为4.1 kDa的活性肽和胞外多糖（郝晓娟），但是目前对该生防菌的活性物质研究得还不够深入，我们在试验中发现，该生防菌有可能还产生其它的活性物质，因此，在本研究中，我们对其产生的活性物质进行了分离，研究了该活性物质粗提物在不同有机溶剂中的溶解性，并对不同有机溶剂中的活性物质成分进行了分析，希望对该生防菌活性物质的分析能够为后续的物质进一步的纯化分离提供依据，同时也对生物农药的研制提供一定的理论依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料 试验材料：生防菌JK-2（短短芽孢杆菌，Brevibacillus brevis），系本实验室从发生枯萎病的田块分离得到的一株拮抗菌株。试验试剂：分析纯三氯甲烷、丙酮、无水乙醇和甲醇。试验仪器：美国Agilent公司制造的7890A/5975C气质联用仪（GC/MSD）操作软件：Agilent G1701EA GC/MSD ChemStation。 1.2 试验方法 1.2.1 生防菌JK-2活性粗提物的提取 将新鲜培养的JK-2发酵液常温6000 rpm离心30 min，取上清液，加入60 g/L的大孔树脂AmberliteXAD16混合，28 ℃，160 rpm振荡4 h后，填柱，并用水洗柱后，丙酮洗脱，收集丙酮洗脱液，40 ℃旋转蒸发进行浓缩，得到JK-2活性粗提物。称取50 mg粗提物干粉于玻璃试管中（12×75 mm），分别加入1 mL三氯甲烷、丙酮、无水乙醇、甲醇和二甲基亚砜5种有机溶剂中，常温静置2 h后，取提取液进行活性检测。 1.2.2 不同有机溶剂中生防菌JK-2活性物质的抑菌活性检测 采用双层培养基进行抑菌活性检测（葛慈斌，2009）。在直径90 mm的无菌培养皿中加入20 mL融化的1.8%NA培养基，待其冷却后，加入上层培养基；上层培养基的制备方法为将指示菌大肠杆菌K88的发酵液按照0.5%的比例加入50 ℃左右的NA培养基中，按照25 mL/皿倒入平板中，待冷凝后使用。采用直径7 mm的无菌打孔器在培养基上打孔，取100 μL不同有机溶剂的提取液加入加样孔中，采用等量的以上纯有机溶剂作为阴性对照。将平板置于28 ℃条件下培养16-18 h后进行抑菌活性检测，试验重复3次。 1.2.3 不同有机溶剂中生防菌JK-2活性物质的GC-MS分析条件 色谱条件：采用HP5-MS色谱柱，进样口温度250℃，压力5.5977 psi，总流量104 mL/min，隔垫吹扫流量3 mL/min，分流比100:1。升温程序为：50℃保持2min，以3℃/min上升到120℃保持5min，以10℃/min上升到200℃，然后以20℃/min上升到280℃保持5min。质谱条件：溶剂延迟：4.00min；采集模式：全扫描；EMV模式：相对值；全扫描参数：开始时候的质量数50.00amu，结束时的质量数550.00mu；MS温度：离子源230℃，MS四级杆150℃。 2 结果与分析 不同有机溶剂中生防菌JK-2活性物质的总离子流图谱分析 不同有机溶剂中生防菌JK-2活性物质的总离子流图谱分析表明，在三氯甲烷和丙酮提取物的总离子流图谱中峰面积较大的3个峰分别为羟苯乙