8-(6-氨基己烷)-氨基-NADH的制备和表征.pdfVIP

第 9 卷第 5 期 过 程 工 程 学 报 Vol.9 No.5 2009 年 1 0 月 The Chinese Journal of Process Engineering Oct. 2009 8-(6-氨基己烷)-氨基-NADH的制备和表征 1,2 3 1 1 马洪静 ， 王 平 ， 苏志国 ， 张松平 (1. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190 ；2. 中国科学院研究生院，北京 100049 ； 3. Department of Bioproducts and Biosystems Engineering, University of Minnesota, St Paul, MN 55108, USA) 摘 要：采用 1,6-己二胺对烟酰胺辅酶(NADH)的腺嘌呤C8 位点进行定点修饰，通过 DEAE-Sepharose 层析分离得到 产物 8-(6-氨基己烷)-氨基-NADH. 经优化制备过程和分离条件，其收率可达 60%. 在 pH 2.2~8.0 内系统考察了修饰产 物的 pH 稳定性，结果表明在不同种类的缓冲液中，修饰后辅酶的稳定性均有显著提高，在 pH 6.5 的柠檬酸盐和pH 8.0 的磷酸盐缓冲液中，半衰期分别延长 11 和 5 倍. 通过利用乳酸脱氢酶(LDH)和谷氨酸脱氢酶(GDH)测定修饰前后辅酶 的活性，发现相同反应条件下修饰后辅酶的反应速率分别是天然NADH 的 3.0~3.8 倍(LDH)和 1.3~1.4 倍(GDH). 关键词：8-(6-氨基己烷)-氨基-NADH；辅酶修饰；辅酶稳定性；辅酶活性 中图分类号：Q554 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2009)05−0975−06 1 前 言 酶(Lactate Dehydrogenase, LDH, EC 1.1.1.28 ，来自 辅酶依赖型氧化还原酶类催化的反应在制备手性 Staphylococcus sp.) ， 谷 氨 酸 脱 氢 酶 (Glutamate 醇、羟基酸、氨基酸等方面有广泛应用[1−4] . 由于辅酶按 Dehydrogenase, GDH, EC 1.4.1.3 ，来自 Bovine liver)和乙 化学计量参加反应，且价格昂贵[5] ，因此通常将辅酶与 醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase, ADH, EC 1.1.1.1，来 高分子连接[6−9]或固定化在载体上[10,11] 以实现其在反应 自Saccharomyces cerevisiae)购自 Sigma 公司(St. Louis, 器内的保留和循环再生[12]. 在此过程中，对辅酶进行预 MO, USA) ，丙酮酸钠购自 Acros Organics 公司(Geel, 修饰以引入活性基团通常是关键步骤，这主要是由于天 Belgium) ，其他试剂包括液溴、乙醛、乙醇、二甲基亚 然辅酶的反应活性较差[13,14]且反应位点也有争议[15,16]. 砜(DMSO)、1,6-己二胺等均为分析纯，购自北京化学试 目前大部分报道中高分子化或固定化的辅酶活性通常 剂公司. 2.2 NH (CH) NH-NADH 的制备及性质表征 较低，可能是由