转基因玉米中植酸酶蛋白免疫亲和纯化体系的建立.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（６）：１２５１３０ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 檪 农业生物技术专栏 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 转基因玉米中植酸酶蛋白免疫亲和纯化体系的建立 １ １ １ １ ２ ３ １ 赵倩倩 　周晓今 　柳小庆 　杨文竹 　李素贞 　刘　奇 　陈茹梅 （１中国农业科学院生物技术研究所 作物功能基因组与遗传改良中心　北京　１０００８１） （２河北农业大学　保定　０７１００１　３北京奥创金标生物技术有限公司　北京　１０２６００） 摘要　为深入研究转基因玉米所表达的植酸酶蛋白的酶学性质，评价重组蛋白的致敏性和饲用 安全性，必须获得高纯度植酸酶蛋白。利用识别４个不同表位的单克隆抗体制备了植酸酶蛋白亲 和层析体系。结果显示，通过８０％硫酸铵沉淀植酸酶蛋白粗提液初步浓缩目的蛋白后，再经过透 析去除高浓度盐离子，进而通过免疫亲和层析可获得在ＳＤＳＰＡＧＥ胶上条带单一的植酸酶蛋白， 比活可达４７０．９９Ｕ／ｍｇ。同时，将上述免疫亲和层析法对植酸酶的纯化效果与离子交换层析方法 进行了对比，结果表明免疫亲和层析法具有稳定、快速和纯化产物比活高等优势，所获得的目的 蛋白满足各种检测要求，优于离子交换层析方法。 关键词　植酸酶　蛋白纯化　免疫亲和层析　硫酸铵沉淀　离子交换层析 中图分类号　Ｑ８１９ 　　植酸酶可将植酸分解为肌醇和无机磷，是目前应 　　虽然实验室已经初步建立了从转基因玉米籽粒中 用最为广泛的饲料添加剂之一。在饲料中添加植酸酶 ［９］ 提取植酸酶蛋白的方法 ，并通过离子交换层析获得 ［１２］ 可以提高单胃动物对饲料中植酸磷的利用效率 ，同 了在ＳＤＳＰＡＧＥ电泳上条带单一的植酸酶，开展了相 ［３］ 时降低植酸磷对环境的污染 ；此外它可降低植酸的 关蛋白稳定性和酶学性质研究，然而应用该方法获得 ２＋ ２＋ ２＋ 的目的蛋白产量少，纯度也不能满足致敏性等安全检 抗营养作用，提高动物对 Ｃａ 、Ｚｎ 和 Ｃｕ 等离子及 ［４５］ 测的需求。因此，我们开发了识别不同表位的植酸酶 蛋白质的利用率 ，因此基于该酶的研究有着重要的 理论和应用价值。前期，本实验室已通过基因工程技 蛋白单克隆抗体，并用这些抗体建立植酸酶蛋白的亲 术将来源于黑曲霉（ 和纯化体系，为从转基因玉米中大量制备高纯度的植 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）的ｐｈｙＡ２基因在 玉米胚乳中特异高效表达，实现了基于玉米籽粒作为 酸酶提供理论和方法基础。 ［６］ 生物反应器生产饲用植酸酶的目的 。以玉米种子作 １　材料与方法 为生物反应器生产植酸酶不仅可以在设备、能耗等生 产成本上优于微生物发酵方式，而且在酶学性质、终产 １．１　仪器、试剂、抗体 ［７８］ 　　转植酸酶玉米株系ＢＶＬＡ４３０１０１；植酸酶的单克隆 品形式上更利于饲料加工，具有广阔的应用前景 。 为推进植酸酶玉米产业化进程和获得其应用于饲料加 抗体由北京奥创金标生物技术有限公司制备，来源于 工的安全性证据，需要从转基因玉米籽粒中大量纯化 小鼠杂交瘤细胞；亲和层析柱填料