实验九大鼠肝总磷脂的提取及薄层层析.pdfVIP

大连理工大学 环境与生命学院 实验九 大鼠肝总磷脂的提取及薄层层析 指导教师：金礼吉 副教授 李 宁 工程师 生物科学与工程系生物化学实验教学研究室 大连理工大学 环境与生命学院 实验目的 掌握大鼠总肝磷酯提取的原理和操作方法 掌握薄层层析法的基本原理和使用方法 生物科学与工程系生物化学实验教学研究室 大连理工大学 环境与生命学院 实验原理 1、磷脂提取 • 磷脂是生物膜的主要成分，具有重要的生理功能。它们具有独 特的物理性质，在脂类中极性较大。由于磷脂既具有疏水基 团，又具有亲水基团，故在非极性溶剂及水中都有较大的溶解 度。 • 磷脂易溶于醇、氯仿、乙醚等有机溶剂，但不易溶于丙酮。利 用后一性质可将其与三脂酰甘油分离。 • 抽提磷脂通常用氯仿、甲醇混合液。甲醇有利于脂-蛋白复合 体的裂解，溶解极性大的物质，并抑制脂酶，而氯仿则可溶解 脂类。向氯仿- 甲醇混合抽提液（含总脂，其中包括磷脂）中 加水，使提取液分层，在下层溶剂相中可得到以磷脂为主的提 取物。 生物科学与工程系生物化学实验教学研究室 大连理工大学 环境与生命学院 2 、磷脂的薄层色谱 薄层色谱是将支持物在玻璃板 上均匀铺成薄层。将待分离样品点 在薄层上，然后用适宜的溶剂展 开，从而达到分离鉴定的目的。 本实验以硅胶为支持物，属吸 附层析。薄层层析所用设备简单， 操作容易，层析时间短，分辨率高 及需样量少，因此被广泛应用。 将待测样品与已知图谱的标准 样品在同样条件下进行层析，便可 初步鉴定样品组分。 生物科学与工程系生物化学实验教学研究室 大连理工大学 环境与生命学院 实验器材 匀浆器、带塞离心管（10ml ）、高速离心机、旋转蒸发仪、 蒸馏瓶、刻度吸量管、红外烤箱、微量进样器、电吹风机、层 析缸、干燥器、层析板、喷雾器等 高速离心机 旋转蒸发仪 组织匀浆机 生物科学与工程系生物化学实验教学研究室 大连理工大学 环境与生命学院 红外烤箱 纤维素层析板 层析缸 生物科学与工程系生物化学实验教学研究室 大连理工大学 环境与生命学院 实验试剂 1、氯仿 2、甲醇 3、蒸馏水 4、丙酮 5、层析溶剂:氯仿:甲醇:冰醋酸:H2O=75:35:15:5（V/V） 6、磷脂显色剂（喷雾剂） 试剂Ⅰ：16克钼酸铵溶于120 ml蒸馏水中。 试剂Ⅱ：40 ml浓HCl加10 ml汞，再加80 ml试剂Ⅰ。 喷雾剂：200ml浓H2SO4 加40ml试剂Ⅰ（呈深绿色），再将试剂Ⅱ小 心加入，冷却后用蒸馏水稀释至1升（棕色）。 生物科学与工程系生物化学实验教学研究室 大连理工大学 环境与生命学院 实验步骤 一、总磷脂的提取 1、匀浆：取大鼠肝1g，剪碎后加蒸馏水4ml匀浆， 5000rpm/min离心1小时，弃上清，保留沉淀。 2、总脂抽提：沉淀加水2.4ml、氯仿3.0ml、甲醇6.0 ml（使 氯仿：甲醇：水的体积比1：2：0.3）。混匀，放置并间歇 振摇1小时。8000rpm/min离心20分钟，弃沉淀，脂类保留 在上清中。 生物科学与工程系生物化学实验教学研究室 大连理工大学