菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化及其性质研究实验报告.docVIP

菲律宾蛤仔碱性磷酸酶的分离纯化及 部分性质研究实验报告? 一、实验目的 碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）是广泛分布在植物、动物和微生物体内的一种重要调控酶，可催化各种磷酸基团的水解和转移反应。在鱼类体内，ALP参与葡萄糖、脂类、无机磷及钙的吸收；在甲壳动物体内，ALP参与钙质的吸收、磷酸钙的形成及甲壳素的分泌；在贝类体内，ALP还与维持钙磷比例及角蛋白的分泌直接相关，在贝壳形成过程中起到重要作用。经过纯化的ALP用途也十分广泛，常被应用于核酸、毒物学、医学研究；添加ALP的化妆品有助于皮肤细胞的新陈代谢及再生，ALP也是基因工程中常用的工具酶。 菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）属软体动物门、双壳纲、帘形目、帘蛤科、蛤仔属，具有肉味鲜美、营养丰富、来源广泛、易于养殖、价格低廉等特点，是一种极具开发前景的海洋动物资源。本研究以菲律宾蛤仔为试验材料，分离纯化ALP，研究其酶学性质，不仅为揭示该酶的调控机理奠定基础，而且为菲律宾蛤仔的人工养殖及病害防治提供重要的理论依据。 二、实验原理 选用菲律宾蛤仔作为实验材料，首先分离纯化出碱性磷酸酶。经过Tris-HCl缓冲液浸提后，采用0％-40％硫酸铵饱和度分级沉淀盐析，DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤，从菲律宾蛤仔内脏团中分离得到碱性磷酸酶。再研究其酶学性质，包括ALP的最适反应温度及温度稳定性、最适反应pH及pH稳定性、动力学参数测定和常见金属离子对酶活力的影响。 三、实验用品 1、药品：EDAE-Sepharose Fast Flow为GE-Healthcare产品；对硝基苯磷酸二钠（PNPP）和β-巯基乙醇为Amresco产品；牛血清白蛋白、Tris、SDS、TEMED和考马斯亮蓝G-250均为Sigma产品；Sephadex G-75为Pharmacia产品；其余试剂均为国产分析纯。 2、仪器：2800紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；电脑恒温层析柜，上海沪西分析仪器厂有限公司；双垂直电泳槽，北京市六一仪器厂。 四、实验步骤 1、菲律宾蛤仔ALP的分离纯化 冰盒上取菲律宾蛤仔内脏团，按1：3（m/v）的比例，加入4℃预冷的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 9.0），匀浆1min，然后置于4℃冰箱中浸提4h。4℃条件下，7155×g离心30min。向上清液中缓慢加入硫酸铵粉末至40％饱和度，边加边搅拌，4℃静置2h后，置于冷冻离心机中4℃，7155×g离心30min，收集沉淀，用适量的缓冲液溶解，透析脱盐后上DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱（1×200mm），采用线性梯度洗脱，洗脱液为0.025mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 9.0，含氯化钠浓度梯度0-0.5mol/L），流速为1mL/min，5mL/管，收集合并活力峰，透析脱盐后冷冻干燥成固体。最后上Sephadex G-75层析柱（1×400mm），用0.025mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）洗脱，流速为0.3mL/min，3mL/管，收集活力峰，透析脱盐后冷冻干燥得纯品酶，20℃保存以备用。 2、纯度鉴定及亚基分子量测定 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。 3、酶的最适反应温度及温度稳定性研究 最适反应温度：在pH 9.0条件下，分别测定ALP在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃反应体系中的酶活力。每个温度设3个平行，取平均值。以反应温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标，绘制酶活变化曲线。 温度稳定性：将纯酶液与适量酶活力测定缓冲液混合，分别在25℃、35℃、45℃、55℃放置4h，每小时测定一次酶活力。每个温度设3个平行，取平均值。以静置时间为横坐标，相对酶活力为纵坐标，绘制酶活变化曲线。 4、酶的最适反应pH及pH稳定性研究 最适反应pH：在最适反应温度条件下，分别测定ALP在pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0反应体系中的酶活力。每个pH设3个平行，取平均值。以反应pH为横坐标，相对酶活力为纵坐标，绘制酶活变化曲线。 pH稳定性：将纯酶液与适量pH值分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0缓冲液混合，4℃冰箱内放置4h后，在最适反应温度和最适反应pH条件下，测定剩余酶活力。每个pH设3个平行，取平均值。以反应时间为横坐标，相对酶活力为纵坐标，绘制酶活变化曲线。 5、酶的动力学参数测定 在最适温度和最适p