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浅谈全内反射荧光显微术及其在生物学中的应用 基础医学院 2004 级生物物理专业 刘昭飞 摘要：全内反射荧光显微术是近年来新兴的一种光学成像技术,它利用全内反射产生的隐失 场来照明样品,从而致使在百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比 大大提高。近年来，全内反射荧光显微术已被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像 中。本文简要介绍了全内反射荧光显微技术的基本知识及其在生物学方面的一些应用。 关键词：全内反射荧光显微术 隐失波 生物单分子 引言：世界上第一台光学显微镜的产生，使人们能够观察到肉眼不能观察到的东西。经过几 百年的发展，经过物理学家的不断努力，显微镜的性能不断提高，成像质量大为改进。许多 新的光学显微镜也应运而生，如偏振光显微镜、相差显微镜、倒置显微镜等。但是，在细胞 生物学方面传统光学显微镜始终不能解决生物样本显微中的几个重要问题：1.显微图像的信 噪比不高2.光源对生物样本照射的损伤3.光学衍射所致的分辨极限（R ≥0. 61 λ/nsin θ）。 而这三个问题恰恰是生物单分子探测中亟待解决的问题。 20 世纪30 年代电子显微镜的发展导致了细胞研究的革命,使得生物学家得以从亚显微 水平上认识细胞世界。进入80 年代,非光学类扫描探针显微术特别是原子力显微镜的出现更 是将成像的分辨率推进到纳米的精度。与此同时,新一代光学显微技术也应运而生，它们以 其高的空间分辨率和时间分辨率、无损伤、以及对单分子活体探测的可行性,再次成为生物 学家、物理学家和成像学家们研究的热点。目前国际上公认的最有前途的单分子光学成像技 术有全场相衬显微术、共焦荧光显微术,近场光学扫描显微术和全内反射荧光显微术[1]。这 些技术在分子生物学、分子化学、激光医学及纳米材料等领域受到广泛关注,并产生了深远 的影响。 全内反射荧光显微术是近年来新兴的一种光学成像技术,它利用全内反射产生的隐失场 来照明样品,从而致使在百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比大 大提高。Hirsch field于1965年完成了第一个全内反射荧光实验,这是首次尝试用全内反射荧光 法测液体中的单个分子的荧光。将全反射理论与生物细胞的荧光成像技术相结合的TIR-FM 技术是一种全新的突破.虽然它的具体应用还不到10年的时间,但是它在单分子探测中已显示 出强大的生命力.1995年,Yanagida小组用TIRFM技术首次在液体溶液中得到了荧光标记的单 个蛋白质分子的成像.1996年,Moerner小组又用这项技术实现了限制在丙烯酰胺胶体的纳米 孔中的单分子的三维成像. 至今,全内反射荧光法在理论上和应用上均已得到较大发展,出现了多种全内反射荧光法, 如时间分辨全内反射荧光、多重内反射荧光和全内反射荧光相关光谱等方法。全内反射荧光 配合偏振技术和时间分辨技术在研究表面分子或近表面分子的取向、旋转和荧光寿命方面已 取得很好的效果。 全内反射的基本理论[2][3] 全内反射 全内反射现象是生活中的一种常见现象，如钻石的色彩斑斓和光纤的光线传 播等。如图 1 所示 ，当一束平面光波从折射率为n 的介质进入到折射率为n 的介质中。入 1 2 射光在两介质接触面一部分发生反射，一部分发生折射。入射角θ和透射角θ之间满足关系 1 2 式 n sin θ=n sin θ （1） 1 1 2 2 若n 大于n ，由公式（1）可以看出当入射角增大时，透射角也增大。假设增大到临界 1 2 角θ 时的透射角为 90 °。当光线以大于或者等于临界角θ入射时，入射光在界面处只发生反 c c 射而不再透射进n2介质，也就是发生了全反射。由snell定律可知 -1