酶联配适体技术检测土霉素.pdfVIP

中 文 摘 要 土霉素（oxytetracycline, OTC ）抗菌效果良好、价格低廉，但由于在兽药和饲料添加 剂等方面被滥用，导致动物源性食品中 OTC 残留严重。目前酶联免疫检测（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA ）是检测OTC 等四环素类抗生素的标准方法，但交叉反应严 重，且 OTC 属于半抗原，抗体制备困难，成本高。近年来发现的核酸配适体（aptamer ） 具有抗体的高亲和力、高特异性结合靶分子特性，且具有蛋白抗体无可比拟的其他优点。 本课题拟建立基于配适体的酶联技术检测 OTC 。 本课题合成了以 OTC 为靶分子的单链 DNA 配适体（76 bp ），研究了采用EMSA 法 检测 OTC 和配适体的亲和性。通过改变非变性聚丙烯酰胺凝胶的浓度、结合缓冲液的离 子强度、淬火条件、应用 EB 染色和化学发光法都未检测到配适体和靶分子的结合；将 OTC-HRP 和 B-ATP-aptamer 互补链应用到 EMSA 试验，仍未检测结合。同样结合条件用 超滤-HPLC 法检测 ATP-aptamer 和 OTC-aptamer 的Kd 值，分别为 1.12 μM 、0.780 μM 。 证明 EMSA 法不能用于 OTC、ATP 和配适体的结合检测。 超滤-HPLC 法证明生物素标记修饰 5’端、Poly T 修饰 3’端对 ATP-aptamer 的Kd 值影 响不显著（P0.05 ）；10%全脂牛奶对 ATP-aptamer 的 Kd 值有影响但不显著（P0.05 ）； “ATP-aptamer-PCS2”对 ATP 与 ATP-aptamer 的结合影响较大。 研究了链霉亲合素（streptavidin, SA ）包被、B-OTC-aptamer 在酶标板上固定、OTC 酶标记。通过对包被条件比较试验，优化得出 SA 包被条件：选择洁特高亲和力板，采用 碳酸缓冲液干法包被，SA 浓度为 2 μg/mL，37℃温育 16 h 至全干，包被效果最佳。干法 包被的孔间差 2.95% ，批间差 7.37% 。每孔可结合B-OTC-aptamer 5.36 pmol 。本研究建立 的基于配适体的生物素－亲和素酶联检测方法能够定量测定 OTC，最低检测限为 1.512 g/L，B-OTC-aptamer 的IC50 为 7.56 g/L，检测线性范围是 3.02-16 g/L，批内变异系数为 10.32%，批间变异系数为 16.46%。牛奶中回收率为71-84% 。本方法的检测灵敏度未超过 现有酶联免疫方法，说明配适体的亲和力、检测条件等还有待提高，但本项目的前期试验 为以后的工作打下基础。 关键词：配适体；土霉素；酶联；EMSA ；链霉亲和素；高效液相色谱 I ABSTRACT Extensive use of tetracyclines in veterinary medicine for their application as antibiotics and growth promoters has lead to their accumulation in food products, such as meat, milk, and eggs/chicken and causes serious threat to human health. The most persistent and frequently found contaminated among the tetracyclines is oxytetracycline (OTC) because of its effective antimicrobial properties and low price. Specific detection of OTC is difficult by conventional techniques. Although enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is the standard method to detect OTC residue in foods in most of