琼脂糖接枝透明质酸的生物活性及其用于皮肤再生的研究.pdfVIP

摘要 目的：探讨琼脂糖接枝透明质酸在皮肤再生修复中的作用。 方法：用环氧氯丙烷活化琼脂糖，加入 5kDa 的透明质酸反应，透析纯化- 冷冻干燥法制备得到琼脂糖接枝透明质酸共聚物；采用粘度法测定琼脂糖接枝透 明质酸的分子量；通过红外光谱法、元素分析法、核磁共振法对材料进行结构表 征；利用 MTT 法检测琼脂糖接枝透明质酸共聚物对成纤维细胞（3T3 ）的细胞 毒性。对琼脂糖接枝透明质酸膜进行细胞粘附实验，评价材料的生物相容性；实 时荧光定量PCR （Real-time PCR ）实验检测材料分别作用于3T3 细胞和巨噬细 胞(RAW264.7)后，对3T3 细胞中Ⅰ型及Ⅲ型胶原和对RAW264.7 细胞中TNF-α mRNA 表达水平的影响；并进一步通过蛋白质免疫印迹（Western Blotting ）实验 表明材料作用于 3T3 细胞后，对细胞内分泌Ⅰ型胶原蛋白以及Ⅲ型胶原蛋白的 影响。小鼠皮肤创伤修复实验，表征材料在小鼠皮肤伤口修复中的作用，并通过 对修复部位的皮肤组织进行石蜡切片和HE 染色分析小鼠皮肤伤口修复情况。 结果：红外光谱、元素分析以及核磁共振的分析结果表明成功制备出了琼脂 糖接枝透明质酸共聚物。粘度法测得的琼脂糖接枝透明质酸聚合物的分子量约为 100kDa 左右。MTT 法的结果表明，琼脂糖接枝透明质酸聚合物在2mg/mL 浓度 范围内，72h 时间范围内，无细胞毒性。细胞粘附实验结果表明，经琼脂糖接枝 透明质酸材料涂膜的玻片接种 3T3 细胞 24h 后，细胞能够很好地粘附到涂膜玻 片上，细胞状态良好，表明材料能够和3T3 细胞发生相互作用，进而粘附细胞。 Real-time PCR 实验结果表明，材料与3T3 细胞作用后，3T3 细胞中Ⅰ型胶原和 Ⅲ型胶原的mRNA 水平显著上调，并且Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA 水平的上调 都随着琼脂糖接枝透明质酸材料溶度的增加而递增。Western Blotting 实验进一步 证实材料与 3T3 细胞作用后，细胞中Ⅰ型胶原蛋白以及Ⅲ型胶原蛋白的表达水 平显著上调，并且Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达水平的上调都随着琼脂糖接枝透 明质酸材料溶度的增加而递增，这一结果与之前的Real-time PCR 的结果相一致。 小鼠皮肤创伤修复实验结果表明，琼脂糖接枝透明质酸材料可以减少伤口炎症反 应和瘢痕形成，促进血管生成，加速小鼠皮肤伤口愈合。最后修复部位的皮肤组 织的石蜡切片和HE 染色结果表明，琼脂糖接枝透明质酸材料组伤口复原情况好， I 皮肤创伤经修复后的组织与正常组织类似。 结论：琼脂糖接枝透明质酸共聚物不仅能够与 3T3 细胞相互作用，促进细 胞粘附，还能够提高 3T3 细胞中Ⅰ型胶原以及Ⅲ型胶原的蛋白表达水平，可以 有效促进皮肤修复再生。 关键词：皮肤再生修复；琼脂糖；透明质酸；Ⅰ型胶原；Ⅲ型胶原；组织学 分析 II Abstract Objective: In order to disclose the role of agarose-g-HA in the process of skin regeneration. Methods: Agarose was activated with epichlorohydrin, and then grafted with hyaluronan with molecular weight of 5kDa, to obtain agarose grafting hyaluronan copolymer (agarose-g-HA). The molecular weight of agarose-g-HA was measured by viscosimetry; and its structures were characterized with FT- IR、EA and 1H-NMR. The cell