基于 T7启动子表达系统的呼吸道合胞 病毒微型基因组的拯救.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（９）：１９ 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 研究报告檪 殏 檪 殏檪檪檪檪檪檪檪檪 基于Ｔ７启动子表达系统的呼吸道合胞 病毒微型基因组的拯救 １，２ ２ ２ ２ １，２ １ ２ １，２ 袁　锐 　付远辉 　何金生 　焦月盈 　蒋桂云 　张　梅 　彭向雷 　阚学通 （１安徽医科大学免疫学教研室　合肥　２３００３２　２北京交通大学生命科学与生物工程研究院　北京　１０００４４） 摘要　目的：以Ｔ７启动子表达系统为基础，通过ＲＮＡ病毒反向遗传学操作，拯救人呼吸道合胞病 毒（ｈｕｍａｎｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ，ＲＳＶ）微型基因组。方法：构建可分别表达ＲＳＶ四种核壳体 蛋白的辅助质粒ｐｘ８ＴＰＴ１Ｎ，ｐｘ８ＴＰＴ１Ｐ，ｐｘ８ＴＰＴ１Ｍ２１和ｐｘ８ＴＰＴ１Ｌ以及含增强型绿色 δ δ δ δ 荧光蛋白（ｅｎｈａｎｃｅｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＧＦＰ）开放读码框（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），ＲＳＶ 病毒前导序列（ｌｅａｄｅｒｒｅｇｉｏｎ／ｇｅｎｏｍｉｃｐｒｏｍｏｔｏｒ），转录起始信号（ｇｅｎｅｓｔａｒｔ，ＧＳ）、转录终止信号 （ｇｅｎｅｅｎｄ，ＧＥ）和尾随序列（ｔｒａｉｌｅｒｒｅｇｉｏｎ／ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃｐｒｏｍｏｔｅｒ）等顺式作用元件（ｃｉｓａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）的微型基因组重组质粒ｐＳＣ１１Ｅ，在上述的５个质粒中，均引入Ｔ７ＲＮＡ多聚酶（Ｔ７ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｔ７ＲＮＰ）启动子，经鉴定正确后，先以ｐＳＣ１１Ｅ转染ＲＳＶ感染的可组成型表达Ｔ７多 聚酶的ＢＳＲＴ７／５细胞进行拯救，确定微型基因组编码质粒设计的合理性，而后通过５个质粒共 转染ＢＳＲＴ７／５细胞，并通过荧光显微镜观察荧光的表达情况判断拯救成功与否。结果：成功构 建了基于Ｔ７启动子表达系统的ＲＳＶ微型基因组５质粒拯救系统，并实现了拯救。结论：该系统 的成功构建，有助于今后对ＲＳＶ病毒开展基因修饰研究。 关键词　呼吸道合胞病毒　微型基因组　反向遗传学 中图分类号　Ｑ３４ 　　人呼吸道合胞病毒（ｈｕｍａｎｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌ 本高昂，难以推广，因而开发新的安全有效的疫苗，仍为 ｖｉｒｕｓ，ＲＳＶ）广泛分布于世界各地，是引起婴幼儿急性 首选目标；然而，自发现ＲＳＶ的半个世纪以来，虽然经 下呼吸道感染最重要的病毒性病原，同时也是儿童支气 过了多次的尝试和持续不断的努力，依然没有安全有 ［２３］ 管哮喘发生的重要危险因素之一。２岁前儿童对ＲＳＶ易 效的疫苗可以用于临床 。 感，发病高峰年龄为出生后６周到６个月之间。在美国， 　　ＲＳＶ为副黏病毒科肺病毒属，为非分节段单股负 每年约有１２万未满周岁的婴幼儿因ＲＳＶ入院，有３００例 链ＲＮＡ病毒。病毒粒子由脂质膜包裹核衣壳组成，中 ［１］ 等大小（１２０～３５０ｎｍ），全基因长度约 １５．２ｋｂ，含 １０ 死亡 。面对ＲＳＶ感染造成的巨大经济社会负担，目前 所能采取的治疗措施非常有限，ＲＳＶ特异性免疫球蛋白 个亚基因组ｍＲＮＡ，均带有帽结构和多聚腺苷酸尾，共 （ＲＳＶＩＧＩＶ）和ＲＳＶ单克隆抗体Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ仅用于气管 编码１１种蛋白。其中Ｍ２ｍＲＮＡ包含有两个重叠的开 发育不全及早产儿等高危个体的被动免疫，而且治疗成 放读码框（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）分别编码 Ｍ２１和 Ｍ２２两种不同功能蛋白。ＲＳＶ的１１种蛋白中，负责病 收稿日期：２０１３０４