急性早幼粒白血病 HL60细胞电转染条件的优化.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（４）：７７８２ ? 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 殏檪檪 技术与方法殏檪 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 急性早幼粒白血病ＨＬ６０细胞电转染条件的优化 １ １ ２ １ ３ 王伟佳 　张秀明 　王　前 　温冬梅 　邱宗荫 （１中山市人民医院，南方医科大学　广州　５２８４０２） （２南方医科大学附属南方医院　广州　５１０５１５　３重庆医科大学　重庆　４０００１６） 摘要　目的：比较不同电转染条件下，真核表达载体转染ＨＬ６０细胞的效率，筛选得到针对ＨＬ６０细 胞最佳的电转染条件。方法：采用ｐＤｓＲＥＤＣ１真核表达载体，分别在２ｍｍ和４ｍｍ电转杯中依照不 同电转条件对ＨＬ６０细胞进行转染，根据存活细胞所占比例确定电转参数；在转染４８ｈ后，比较不同 质粒加入量及二甲基亚砜（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，ＤＭＳＯ）加入电转体系前后的细胞转染阳性率。调整 Ｇ４１８筛选浓度，在选定转染条件下进行ＨＬ６０细胞电转，采用流式细胞技术，细胞化学染色及超微结 构观察，分析电转前后ＨＬ６０细胞的生物学性状。应用相同条件再转染ｅＹＦＰＣ１质粒于ＨＬ６０细胞， Ｇ４１８筛选后观察荧光表达情况。结果：ＨＬ６０细胞在２ｍｍ和４ｍｍ电转杯中的死亡数量随电击强度 和脉冲次数的增加而升高，且方形波较回旋波有更强的击穿细胞膜的能力；固定电转参数下，２ｍｍ和 ４ｍｍ电转杯中的ＨＬ６０细胞电转阳性细胞数随加入质粒量的增加呈先升高后下降的趋势，且在相同 质粒加入量，２ｍｍ电转杯比４ｍｍ电转杯有更高的转染效率；在相同电转参数和相同电转杯中，预冷 条件下加入ＤＭＳＯ电转时阳性率比不加入ＤＭＳＯ进行电转的阳性率高近１３倍；４００ｇ／ｍｌＧ４１８是 μ 最佳筛选浓度；选定最佳电转条件进行电转，通过筛选，没有发现细胞表面分化抗原ＣＤ１１ｂ和ＣＤ１４ 的表达，细胞形态原始，未见凋亡现象发生。相同条件电转ｅＹＦＰＣ１空载质粒于ＨＬ６０细胞仍然可 以获得很好的转染效果。结论：ＨＬ６０细胞电转染条件的改良，可以有效提高ＨＬ６０细胞的电转阳性 率，为后续细胞真核表达载体的转染及基因功能研究奠定基础。 关键词　转染　电穿孔　ＨＬ６０细胞 中图分类号　Ｑ８１９ 　　ＨＬ６０细胞是一种急性髓系白血病细胞株，是血液 这个问题，本研究对耗时短，且价格低廉的电转染技术 疾病研究中理想的细胞模型，其最大的特点是在分化 进行优化，以期寻找一个有效的方式提高转染效率，为 诱导剂的作用下具有多向性分化的能力，而且具有可 后续细胞中的基因功能研究奠定基础。 ［１］ 靠的反映细胞功能的细胞化学指标 。以ＨＬ６０细胞 １　材料与方法 为模型做基因功能研究，可以更直接地了解该基因在 粒单祖细胞阶段的作用。但由于悬浮细胞采用脂质体 １．１　细胞系及其他主要材料 转染比较困难，且病毒载体的构建无论从构建时间还 　　人髓系白血病细胞系ＨＬ６０（上海细胞库生命科学 是经费消耗都比较大，使得真核表达载体在ＨＬ６０细胞 研究所）；细胞培养基 ＲＰＩＭ１６４０（美国ＧＩＢＣＯ公司）； 的转染成为对基因功能进一步研究的瓶颈。为了解决 胎牛血清（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司）；抗ＣＤ１４，ＣＤ１１ｂ及其对 照抗体（深圳晶美公司）；ｐＤｓＲｅｄＣ１红色荧光标记空 收稿日期：２００９１１０６　　修回日期：２００９１２２