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生物化学综合实验血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 实验目的 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 蛋白质分离纯化与鉴定 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 一、盐析法粗分离血清γ-球蛋白 盐析法分离血清球蛋白 具体操作 二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐 凝胶柱层析脱盐 目的与要求 凝胶层析法原理 葡聚糖凝胶（Sephadex) ▲ 加样与洗脱 ▲ 凝胶的再生 三、DEAE－纤维素离子交换层析 离子交换层析的基本原理 离子交换层析的基本原理 蛋白质的电离示意图 DEAE－纤维素离子交换层析纯化γ－球蛋白 操 作 四、γ－球蛋白纯化液的浓缩 五、γ－球蛋白鉴定 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定 醋酸纤维素薄膜电泳 操作步骤： 1、装置电泳箱。区分电泳箱正负极 。 2、点样：浸于巴比妥溶液中的薄膜，滤纸轻轻吸 干—半干燥态。铅笔标记；点样器沾适 量新鲜血清，垂直点样。 3、放入电泳槽，使膜保持水平。 4、通电：110伏，1小时。断电后，取膜。 5、染色：氨基黑10B染色10min。 6、浸洗：浸洗液浸洗3次，每次5-10min。 按泳动快慢顺序分为：清蛋白、α1、α2、β、γ—球蛋白。 试剂材料 仪器 注意事项 思考题 电泳条件：电压：90－110 V； 时间：50分钟。 染 色：电泳毕，关电源。取出薄膜浸入盛有氨基黑10B 染色液的染色缸中染色5分钟，用2.5 %醋酸洗脱液漂洗，直至背景呈白色。取宽薄膜一张，3个样品点在同一水平，以血清蛋白图谱为对照，观察提纯物属哪种蛋白，其纯度如何。 快 + 铅笔标记 ，垂直点样 保持膜不下垂 半干燥态 注意事项： 1 、区分电泳槽正负极。 2 、点样处放在负极端，保持膜水平。 饱和硫酸铵溶液 纳氏试剂 Sephadex G 25 DEAE－纤维素 醋酸纤维素薄膜 离心机 层析柱 紫外分光光度计 小烧杯 小试管 铁架台及铁夹 电泳槽 白瓷板等。 * * P、180 重庆医科大学基础医学实验教学中心 生物化学与分子生物学实验室 2008年10月 生物化学实验 CQMU 从人血清中分离纯化γ-球蛋白 实验方法 一、盐析法粗分γ-球蛋白 二、凝胶过滤方法脱盐 三、离子交换层析方法纯化γ-球蛋白 四、醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度 本实验综合多种实验技术和方法，共同完成一个实验目标，所以属于综合性实验。 【实验目的】 1．学习了解凝胶层析和离子交换层析分离纯化 蛋白质的基本原理及应用 2．掌握醋酸纤维薄膜电泳技术的原理及应用 【基本原理】 蛋白质的分离、纯化及鉴定是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段之一。 分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质的不同而建立的方法，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳、离心等。在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。 【实验原理】 本实验采用硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶过滤、离子交换层析方法，分离纯化血清γ-球蛋白。最后用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度。 原理 盐析法是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度度不同，从而分别析出，达到彼此分离的分离方法。 本实验在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白溶解，球蛋白将沉淀析出，经离心所得的沉淀即为球蛋白的粗提液。 硫酸铵是蛋白质盐析常用的中性盐，在0～30℃范围内溶解度变化不大；25℃时饱和溶解度为4.1 mol/l，0℃时饱和溶解度为3.9 mol/l。在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以析出来。而且硫酸铵价廉易得，分段盐析效果好，不容易引起蛋白质变性。 硫酸铵分段盐析：血清1.0 ml，一边摇一边缓慢加入饱和硫酸铵1.0 ml，混匀后室温下静置10分钟，3000 rpm离心10分钟。用滴管仔细地吸出上清，弃去。沉淀加0.02 mol/l pH 6.5 磷酸缓冲液4.0 ml溶解，此为球蛋白粗提液，留作进一步纯化。 欲去除盐析法分离得到的球蛋白粗提液中大量盐，通常有两种方法： 凝胶层析法 透析 本试验采用葡聚糖凝胶——Sephadex G 25层析方法除去球蛋白粗提液中的盐硫酸铵，以便下一步用离子交换层析方法进一步提纯球蛋白。 1.学习了解凝胶 层析的原理 2.熟练了解凝胶 层析的用途 凝胶层析原理：