植物表达载体pCAMBIA230035SGUSCaMVterm的构建及验证.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（３）：８６９１ 植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ２３００３５ＳＧＵＳ ＣａＭＶｔｅｒｍ的构建及验证 １，２ ２ １ １ １ ２ 巩元勇 　冯永坤 　倪万潮 　束红梅 　郭书巧 　刘来华 （１江苏省农业科学院经济作物研究所 农业部长江下游棉花和油菜重点实验室　南京　２１００１４） （２中国农业大学资源、环境及粮食安全中心 教育部植物与土壤互作重点实验室　北京　１００１９３） 摘要　为拓宽ｐＣＡＭＢＩＡ２３００表达载体的使用范围，进一步方便植物基因工程科研工作者在构建 表达载体时的需要，利用Ｓａｃ 和Ｘｈｏ 双酶切ｐＪＩＴ１６６载体获取“３５ＳＧＵＳＣａＭＶｔｅｒｍ”片段，将该 Ⅰ Ⅰ 片段插入到 ｐＣＡＭＢＩＡ２３００表达载体的多克隆位点区，构建完成了 ｐＣＡＭＢＩＡ２３００３５ＳＧＵＳ ＣａＭＶｔｅｒｍ表达载体。所构建的表达载体通过农杆菌介导转化拟南芥，获得拟南芥转基因植株，转 基因植株的ＧＵＳ染色结果进一步验证了本文所构建表达载体的正确性和实用性。该表达载体的 成功构建，方便了构建基因超表达载体，以及使得研究启动子的活性及ＧＵＳ组织化学定位成为可 能，还可以通过ＧＵＳ染色对转基因植物进行鉴定，为植物基因工程科研工作提供了一个较好的备 选植物表达载体。 关键词　植物表达载体　ｐＣＡＭＢＩＡ２３００　ｐＪＩＴ１６６ 中图分类号　Ｑ８１２ 　　ｐＣＡＭＢＩＡ系列载体是植物基因工程中最常用的植 基因的 ＤＮＡ片段，通过 ＸｈｏＩ和 ＫｐｎＩ位点插入 物双元表达载体之一，ｐＣＡＭＢＩＡ２３００因其在植物转化 ｐＣＡＭＢＩＡ２３００载体，转化水稻 ｌｔｎ１突变体植株用于 时具有最短的异源序列，所以在ｐＣＡＭＢＩＡ系列中被归 ［２］ ＯｓＬＴＮ１基因的功能互补研究；巩元勇 克隆了全长为 到“最小选择载体”之列。ｐＣＡＭＢＩＡ２３００的载体骨架 ５５９０ｂｐ的ＡｔＧＬＲ２．５基因的基因组核苷酸片段，通过 是ｐＵＣ１８，全长８７４２ｂｐ，在细菌和植物转化时所用的选 在该序列两端添加 的 ＢａｍＨ Ｉ酶切位点 连入 ① 择标记都是卡那霉素（Ｋａｎ） ，在其多克隆位点区域 ｐＣＡＭＢＩＡ２３００载体，转化拟南芥 Ａｔｇｌｒ２．５１突变体植 （ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅｓ，ＭＣＳ）包含 ＥｃｏＲ 、Ｓａｃ 、Ｋｐｎ Ⅰ Ⅰ ［３］ 株用于ＡｔＧＬＲ２．５基因的功能互补研究；Ｚｈｏｕ等 将 、Ｓｍａ 、ＢａｍＨ 、Ｘｂａ 、Ｓａｌ 、Ｐｓｔ 和Ｈｉｎｄ 等９ Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅲ ２ｋｂ的ＭＯＭ１基因启动子序列、ＭＯＭ１基因ＣＤＳ和１．５ 个常用的限制性内切酶酶切位点（图１），但是不包含其 ｋｂ的ＭＯＭ１基因编码区终止子后的ＤＮＡ序列片段分 它的功能基因元件（组成型启动子、终止子和报告基因 别通过 Ｓａｌ ＢａｍＨ ，ＢａｍＨ Ｋｐｎ ，和 Ｋｐｎ  Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ 等）。因此该表达载体最直接的应用是，在 ＭＣＳ选择