一种以木瓜蛋白酶为内标基因的转基因番木瓜定性及定量PCR检测方法.pdfVIP

农业生物技术学报 1521 Journal。f AgriculmralBi。techn。1。gy 科学通讯一分子检测 Detection ScienceCommunication--Molecular 一种以木瓜蛋白酶为内标基因的转基因番木瓜定性及定量PCR检测 方法 A asan Gene，Papain，UsedEndogenous Papaya—specific Genein andReal．．time PCRDetectionofTrans．． Qualitative Quantitative genicPapayas 番木瓜(CaricapapayaL．)是热带和亚热带种植最广泛的水果，但由于受番木瓜环斑病毒(Papaya ringspotvirus，PRSV)的影响使得经济效益降低。随着生物技术的发展，病毒抑制基因开始被转入到植物 中，形成新型转基因植物，同时转基因番木瓜也得到商业上的认可，并开始在许多国家大量种植。在转基 因番木瓜的传统检测中存在引物灵敏度低、无法测量基因拷贝数和等位基因变异分析等问题，从而无法 实现定量检测，这些因素严重限制了检测手段的应用。 传统检测方法大多依赖一个基因检测估算转基因成分的含量，本研究在传统方法的基础上进行改进 创新，一次检测多个基因，通过计算每个基因的拷贝数来精确定量转基因成分，建立了全新的转基因番木 瓜定性定量PCR检测方法。木瓜蛋白酶是调控肽链内切酶和半胱氨酸蛋白酶的典型家族遗传基因。故 本研究以木瓜蛋白酶作为内标基因，首次利用DNA印迹杂交实验验证了木瓜蛋白酶基因的拷贝数和特 异性，同时验证了木瓜蛋白酶基因在所有的番木瓜品系中都不存在等位基因变异。针对此基因设计了两 对新引物，分别用于定性及定量PCR方法检测转基因番木瓜成分，同时选取转基因番木瓜的PRSV-CP基 因和PRSV-RP基因作为鉴定基因。经过实验验证，在传统PCR方法中，转基因番木瓜成分最低检测限是 10 pg(37拷贝)，而在实时定量PCR方法中，最低检测限为1 pg(5-3拷贝)。研究结果表明，本实验方法能 有效地检测转基因番木瓜成分，同时具有高效的特异性和精确的灵敏度，能够有效地检测低拷贝的深加 工产品。 本研究建立的方法可以通过检测木瓜蛋白酶基因拷贝数及cP基因拷贝数，进而有效地分析出番木 瓜加工产品中转基因番木瓜的百分含量，该方法可以更好地应用到深加工产品的检测中。 论文作者：许文涛，白卫滨，郭峰，罗云波，元延芳，黄昆仑 Guo YuanYand 信息来源：xu F，Luo as W，BaiWj Y K，2008．A Huang papaya—specificgene，papain，used an referencein and endogenousgene Real—time PCRdetectionof qualitative quantitative transgenicpapayas． FoodResearchand European