LOX1特异性小发夹RNA表达载体的构建及其对巨噬细胞源性泡….pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（１０）：６～１１ ＬＯＸ１特异性小发夹ＲＮＡ表达载体的构建及其 对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响 杨慧宇　边云飞　杨志明　张娜娜　肖传实 （山西医科大学第二医院　太原　０３０００１） 摘要　目的：靶向血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体１（ＬＯＸ１）基因的发卡样ｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）表 达载体的构建及其对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响。方法：（１）采用ＤＮＡ重组技术，将 ＬＯＸ１ｓｈＲＮＡ双链与线性化ｐＧｅｎｅｓｉｌ１质粒表达载体连接，构建ＬＯＸ１特异性小发夹ＲＮＡ表达 载体ｐＬＯＸ１ｓｈＲＮＡ１及ｐＬＯＸ１ｓｈＲＮＡ２，用脂质体法转染小鼠单核巨噬细胞（ＲＡＷ２６４．７），半定 量逆转录聚合酶链反应法检测ＬＯＸ１ｍＲＮＡ的表达，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＬＯＸ１蛋白的表达，选择 沉默效果最佳的作为下一步的干预序列。（２）ｏｘＬＤＬ诱导巨噬细胞建立泡沫细胞模型，ｐＬＯＸ１ ｓｈＲＮＡ进行干预，干预组使用脂质体法进行细胞转染，转染２４小时后，再加入ｏｘＬＤＬ作用２４小 时，用油红Ｏ染色法及细胞内游离胆固醇及总胆固醇测定法观察对泡沫细胞形成的影响，倒置荧 光显微镜观察ＲＡＷ２６４．７细胞对ＤｉｌｏｘＬＤＬ的摄取率。结果：测序鉴定发现插入的发卡样序列 正确，成功合成了发卡样ＬＯＸ１基因ＲＮＡ干扰表达载体，ｐＬＯＸ１ｓｈＲＮＡ１及ｐＬＯＸ１ｓｈＲＮＡ２转 染ＲＡＷ２６４．７细胞后，其 ＬＯＸ１基因和蛋白表达显著下调，并且以ｐＬＯＸ１ｓｈＲＮＡ２沉默效果最 佳。结论：成功构建了能有效抑制ＬＯＸ１基因及蛋白表达的干扰表达载体，同时可抑制巨噬细胞 源性泡沫细胞形成及对ＤｉｌｏｘＬＤＬ的摄取，为进一步利用ＲＮＡ干扰技术防治动脉粥样硬化提供 理论基础。 关键词　血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体１　发卡样ｓｉＲＮＡ　ＲＮＡ干扰　巨噬细胞源性泡沫细 胞 中图分类号　Ｒ３３１．３＋６　Ｒ５４１．４ 　　 氧化型低密度脂蛋 白（ｏｘｉｄｉｚｅｄｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ 胞形成方面扮演了重要角色，但是目前 ＬＯＸ１在巨噬 ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｏｘＬＤＬ）在动脉粥样硬化形成和发展过程中 细胞泡沫化过程中的作用研究甚少。ＲＮＡ干扰是一种 起着关键的作用，而血凝素样氧化型低密度脂蛋白受 特异性的基因沉默技术，能抑制靶基因的转录。本研 体１（ｌｅｃｔｉｎｌｉｋｅｏｘｉｄｉｚｅｄｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ 究通过构建ＬＯＸ１基因的发卡样 ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎ １，ＬＯＸ１）是ｏｘＬＤＬ在血管内皮细胞上的主要受体，在 ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ）真核表达载体，沉默 介导ｏｘＬＤＬ对血管内皮细胞的损伤、参与动脉粥样硬 ＬＯＸ１基因表达，探讨 ＬＯＸ１在巨噬细胞泡沫化过程 化的形成和发展过程中发挥了重要作用［１～３］。Ｙａｓｈｉｄａ 中的作用，并观察对ＤｉｌｏｘＬＤＬ摄取率的影响。 ［４］ 等 研究发现巨噬细胞膜上亦有ＬＯＸ１表达，其基因 １　材料与方法 序列同内皮细胞上的ＬＯＸ１完全相同，并且可识别和 结合ｏｘＬＤＬ，提示巨噬细胞表面ＬＯＸ１可能在泡沫细 １．１　试　剂 　　Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ（大连宝生物工 收稿日期：２００９０４０１　　修回日期：２００９０６０９ 山西省科技攻关项目（２００９０３１１０５９３） 程有限公司）Ｔｒｉｚｏｌ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ）；油 通讯作者，电子信箱：ｙｈｙ０６０３＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ 红Ｏ（Ｓｉｇｍａ公司）；总胆固醇和游离胆固醇试剂盒 ２００９，２９（１０）杨慧宇等：ＬＯＸ１特异性小发夹ＲＮＡ表达载体的构建及其对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响