巢蛋白样结构域蛋白的表达、纯化与鉴定.pdfVIP

南京医科大学学报 (自然科学版) 第 31卷第 12期 · l748· ACTAUNIVERSITATISMEDICINALISNANJING(NaturalScience) 2011年 12月 巢蛋白样结构域蛋白的表达、纯化与鉴定 苗永昌 ，朱 毅，张静静，王 斌，徐泽宽 (南京医科大学第一附属医院普通外科 ，江苏 南京 210029) [摘 要] 目的：重组构建原核表达载体以正确表达巢蛋白样结构域 (nidogendomains，NIDO)蛋白，并进一步纯化与鉴定。方 法：PCR法拼接NIDO基因，经T．A连接亚克隆至pMD19一T载体，测序鉴定。采用质粒抽提、纯化、酶切 、连接、感受态细胞制备 和转化等技术，构建并鉴定原核表达载体pGEX一4T．1．NIDO。药物诱导方式诱导NIDO：GST融合蛋白的表达。对表达产物进行分 离，用SDS—PAGE检测上清与包涵体沉淀中目的蛋白的表达量。对包涵体进行变性和透析复性后，进行 GST亲和层析纯化。采 用SDS—PAGE和质谱分析，鉴定纯化的目的蛋白。结果：测序证实了NIDO基因的正确合成和pMD19一T—NIDO克隆载体的构建。 原核表达系统pGEX4T．1一NIDO构建成功，在大肠杆菌 BL21中被诱导，获得高表达量的N一末端带有GST标签序列的重组融合 表达蛋白(30％)。超声裂菌法分离的结果显示 ，目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多。将包涵体变性、复性后用 GST亲和 层析纯化 ，纯化蛋白80％并经质谱鉴定证实。结论：成功构建原核表达载体 pGEX一4T．1．．NIDO。能正确表达NIDO—GST融合蛋 白，GST亲和层析对于NIDO—GST融合蛋白有较好的纯化效果。 [关键词] 巢蛋白；NIDO；序列分析 ；载体构建 ；蛋白表达；质谱 [中图分类号] R394 [文献标识码] A [文章编号] 1007—4368(2011)12—1748—04 Cloning，expressionandpurificationoftheimportantNIDO Domainprotein MIAO Yong—changAt ZHUYi，ZHANGJing-jing，WANGBin，XUZe—kuan (DepartmentofGeneralSurgery，theFirstAffiliatedHospitalofNJMU，Nanjing210029，China) [Abstract] Objective：ToconstructrecombinantprokaryoticexpressionvectortoexpresstheimportantNIDODomainproteinand furtherpurifyandidentifytheNIDO protein．Methods：TheNIDO genewassubclonedintopMD19一T vectorforDNA sequencing analysis．Plasmid extraction，purification，enzyme，connection，competentcellpreparation and transformation technology were per— ofrmedtoconstructandidentifytheprokaryoticexpressionvectorpGEX一4T一1一NIDO．TheproteinNIDO—GSTwasexpressedinE．coli— BL21asafusionprotein inducedbyIPTG．Theexpressionproductswereisolated，andthetargetproteinsofsupernatantsandinclu— sionprecipitationweredetectedby12％SDS—PAGE．Afterdenaturationandrenaturation ofinclusionbody，theexpression products werepurifiedbyGST—affinitychromatography．ThepurityofNIDO—GSTfusionproteinwasidentifiedby 12％ SDS—PAGE andthe Mass—Spec