长白猪IL-4基因克隆及真核表达载体的构建.pdfVIP

留国固 长 自猪IL-4基因克隆 及真核表达载体的构建 王 彬，汤德元 ，李春燕．曾智勇，王 凤，甘振磊，周厚品 (贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025) 摘 要：将长白猪外周血淋巴细胞在刀豆素A (ConA)的刺激下培养24h后，提取其总RNA，应用RT-PCR技术 扩增白细胞介素一4 (IL一4)cDNA，克隆~pMD19一T载体并测序。将构建好的载体双酶切并回收目的片段与 pcDNA3．1(+)载体连接并转化入Top10中构建真核表达载体，真核表达载体经双酶切及测序结果表明：克隆的 lL一4cDNA全长为411个碱基，其中ORF为402个碱基，编码133个氨基酸，与GenBank公布的猪IL-4J；~对同源性为 100％，从而证实成功构建了长白猪IL-4cDNA真核表达载体。 关键词：长白猪；IL-4基因；真核表达裁体；构建 白介素4(Interleukin一4，IL一4)在 因进行扩增和序列测定并构建真核表达 司 ；长 白猪，购 自贵州种猪场。 1982年作为影响B细胞生长的T细胞 载体 ，旨在为进一步研究长 白猪 IL一4 1．2 方法 来源因子而被首次发现，是由抗原或有 功能性蛋白的有效表达、生物学活性及 1．2．1 引物设计与合成 丝分裂原诱导Th2细胞、嗜酸性粒细 其作为分子佐剂在疫苗免疫中的促进作 根 据 GenBank已刊载 的猪 IL-4 胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生，是 用奠定基础 。 基 因 mRNA序 列 (NM一214123．1)设 Th2细胞受刺激后产生的主要细胞 因 1 材料与方法 计 1对 引物，并分别在 引物的 5 端 子。IL-4具有重要的免疫功能，主要 1．1 材料 设 计BamH I和 EcoR I限制 性 内 作用于 B细胞，能促进B细胞增殖，对 RPMI1640培养基，购 自Hydone公 切 酶位 点，为 与载 体连接 表达 做准 B细胞早期发育和以后的发育起着重要 司 ；TRlzol Reagent，真核表达载体 备。IL一4引物 由大连宝生物工程公司 作用，能显著增强B细胞对抗 IgM 抗 ImDNA3．1(4-)，购于hvitrogen生物公司； 合成，引物序列如下 ：PrimerF5 一 体和脂多糖的免疫反应 ；能促进抗体的 pfuDNA聚合酶，购于默克生物工程有 CGGG C TTCATGGGTCTCACCT 产生和类别转化为 IgE、IgG1；能促进 限 (STRATAGENE)公 司 ；pMD19-T C-3 ；PrimerR 5 -CGGAATTCT 50％的休止T细胞进行分裂，使Th0 载 体 试 剂 盒 ，TaqDNAPotymerase、 CAGCTTCAACACTTTGA 一3 。 细胞 向Th2细胞分化 ，是 Th2细胞分 BamHI、EcoR I限 制 性 内 切 酶， 1．2．2 淋巴细胞的分离与培养 泌的自我调节生长因子，它还能增强巨 DL2000DNAMarker等，购 自大连宝 无菌采取健康长 白猪前腔静脉血 噬细胞的抗原递呈能力及对肿瘤细胞的 生物工程有限公司 ；DNAMarkerI购 10mL，用 3．8％的柠檬酸钠抗凝，然 细胞毒作用 …。在现代养猪生产中，长 干 TIANGEN ；胶 回收试剂盒，Topi0 后加入等量 D-hank S液稀释 ；取 白猪是品种选育中重要的种质资源。本 购于TIANGEN公司 ；ConA，淋巴细 稀释的外周血缓慢加入到等量的淋巴 试验对长 白猪外周血淋 巴细胞 IL一4基 胞分离液，购 自北京索莱宝科技有限公 细胞分离液 中 ，2000r／min室温离心 20rain；吸取雾状层，加入D—hank S 基金项 目：贵州省贵阳市2005年畜牧科技专项基金项 目资助 [编号 ：(2005)筑科 液 洗涤，2000r／min离 心洗涤 3次， 农字第4-1