子宫内膜胞分离培养方法的改良及其雌二醇分泌水平评价.pdfVIP

细胞生物学杂志 ChineseJournalofCellBiology2009，31(5)：699-704 http：／／www．cjcb．org 子宫内膜细胞分离培养方法的改良及 其雌二醇分泌水平评价 李 傲 徐晓玉1 (重庆理工大学化学与生物工程学院，重庆400050；西南大学药学院与中医药学院，重庆400716) 摘要 本研究对现有子宫内膜腺上皮和基质细胞的培养方法加以改良，并对分离与混合培 养的子宫内膜细胞分泌的雌二醇水平进行比较，探讨子宫内膜异位症(简称内异症)子宫内膜局部高 浓度雌二醇的生成来源。通过高浓度胶原酶和DNase联合消化、筛网过滤及贴壁纯化法，分离纯 化25例子宫内膜腺上皮和基质细胞，通过形态学观察和细胞免疫荧光法鉴定，22例分离成功的内 膜细胞中腺上皮细胞和基质细胞的纯度均在95％以上。电化学发光免疫法检测内膜细胞培养液上 清液中的雌二醇水平，结果显示，内异症在位 内膜细胞混合培养组的分泌水平最高，明显高于其它 各组(尸O．O1)，而经过分离培养后的内异症在位内膜腺上皮细胞组明显高于基质细胞~．fl-(P0．01)。 在非内异症内膜细胞的混合和分离培养组中，细胞分泌雌二醇的水平极低，接近最低检测值。显示 内异症患者从其发病的源头一 在“位内膜”就已表现出高分泌雌激素的特征。 关键词 子宫内膜异位症；腺上皮细胞；基质细胞；细胞培养；雌激素 子宫内膜异位症(以下简称为内异症，endome． 期在位 内膜子宫。术 中切除子宫，纵形切开子宫肌 triosis，EMS)是一类雌激素依赖性疾病，异位子宫内 层，暴露宫腔，用无菌手术刀刮取内膜组织，所有标 膜类似于肿瘤 的恶性生物学行为受到血液及病灶局 本均使用预冷的无菌生理盐水漂洗 3次后，置于冰浴 部雌激素的调节Ⅲ。 目前，培养异位子宫内膜细胞时 的DMEM／F一12(D／F)培养基中，211内进行分离培养 存在量少和成功率不高等问题，根据Sampson的经血 操作 。 逆流种植学说，异位病灶的子宫内膜组织来源于在位 1．2试剂及仪器 内膜2[1。越来越多的资料表 明[3]，内异症患者在位 内 无酚红DMEM／F-12∞ 培养基、胶原酶I(Gibco 膜的遗传和功能特性与异位 内膜相似 ，但与正常 内膜 公司)；胰蛋白酶、TritonX一100(Amresco公司)；雄烯 差异较大。因此，国内有学者提出了 “在位 内膜决 二酮(Sigma公司)；DNA酶(WorthingtonBio—chemical 定论 ”假说，对种植学说进行了极为重要的修正和 公司)；胎牛血清(杭州四季青生物公司)；鼠抗人波形 完善…。本实验对既往在位 内膜细胞的培养方法加 蛋 白(vimentin)、鼠抗人角蛋 白(cytokeratin)抗体 以改进，建立纯度高、数量大的在位 内膜混合及单 (SantaCruz公司)、封闭用正常羊血清、FITC标记 一 细胞培养模型，并分别对其分泌的雌二醇水平进行 羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；雌 检测，其结果不仅为 “在位 内膜决定论 ”提供新的 二醇发光免疫测试盒(Roche公司)；YCP．200型细胞培 佐证，同时也为研究内异症的发病机制和治疗药物提 养箱(上海易亮医疗器械有限公司)；倒置显微镜 供 良好的体外模型。 (TE2000一U，日本Nikon公司)；激光共聚焦显微镜(TCS SP2，德国Leica公司)；Elecsys2010型 自动电化学发 1材料与方法 光免疫分析仪(美国Roche公司)。 1．1组织来源 1．3