骨形成蛋白7基因诱导人肝癌细胞的凋亡.pdfVIP

中国生物工程杂志 ChinaBioteehnology，2009，29(11)：7～11 骨形成蛋 白7基因诱导人肝癌细胞的凋亡 肖时湘 张 宁 (天津市第三 中心医院 天津 300170) 摘要 目的：构建表达重组人骨形成蛋 白7(bonemorphogenicprotein7，BMP7)基 因的重组逆转 录病毒，观察其对人肝癌细胞 HepG2的凋亡诱导活性，并探讨其作用机制。方法：克隆BMP7基 因，以loxP同源重组法构成逆转录病毒载体pLP—LNCX．BMP7(pLLBMP7)，转染包装细胞PT67进 行病毒包装并测定病毒滴度；将逆转录病毒感染人成骨细胞，MTr法检测细胞生长变化，琼脂糖 凝胶 电泳和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡；Westernblotting检测 BMP7，caspase一3和 bcl一2蛋 白 表达。结果：重组逆转录病毒载体 pLLBMP7经鉴定连接正确，转染PT67细胞后上清液 中可得到 病毒，滴度达 1×10pfu／ml；MTr检测见 pLLBMP7病毒组48h和 72h细胞抑制率高于对照组 (35．1％VS．5．3％，68．5％VS．18．3％，均P0．05)，48h可见 BMP7蛋 白高表达。琼脂糖凝胶 电 泳出现典型梯形条带；流式细胞仪检测出现凋亡峰，于转染48h后达最高峰，其凋亡百分率高达 14．42％；BMP7蛋 白高表达时caspase．3蛋 白的表达亦有显著升高，但 bcl-2蛋 白未见表达差异。 结论：构建了BMP7逆转录病毒，在体外能够有效地诱导人肝癌细胞 HepG2的凋亡，其可能是通 过激活 caspase．3而发生作用 关键词 骨形成蛋白7基因 逆转录病毒 肝癌细胞 凋亡 中图分类号 Q789 骨形成蛋 白(bonemorphogenicprotein，BMP)广泛 脂质体购 自invitrogen公司；限制性 内切酶购 自Gibcol 存在于人体多种组织和细胞 内，并参与胚胎的发生和 BRL公司；DNA凝胶 回收试剂盒和病毒DNA提取试剂 发育，组织细胞的分化和增殖。目前已知有 16种不同 盒均购 自上海生工生物工程公司；鼠抗人BMP7抗体购 的人骨形成蛋白cDNA得到克隆，在 BMP家族中具有 自Santa公司；细胞凋亡 DNALadder提取试剂盒购 自 较强功能活性者为BMP-2、BMP4和 BMP-7，其主要是 博大科技公司。 通过受体传递信号而诱导凋亡是其发挥作用的重要方 1．2 引物设计与合成 式 。本 实验 构 建 BMP7基 因逆 转 录病 毒 载体 BMP7全 基 因序 列 的 GenBank 目录 号 为 pLLBMP7，观察了其在体外诱导人肝癌细胞 HepG2的 AF257775，利用引物设计软件 PrimerPremier5．0进行 凋亡作用，从而为BMP7选择性诱导细胞凋亡分子机制 引物设计 ，其序列如下： 的进一步研究打下基础 。 BMP7一F：5 一GAA GTFATC AGT CGA CAT GCA TACTCATCA GGA CTTTCA-3 39base 1 材料与方法 BMP7-R：5 一 GAT CCT GCA GGA ATT CCT ATI 1．1 材 料 TGG AGA AAG AGG TCA T一3 37base 模板质粒pUC—BMP7，由中国科学院研究生院生命 1．3 RT-PCR法克隆BMP7基因 科学学院惠赠；人肝癌细胞 HepG2，购 自中科院上海细 健康成人外周血分离 白细胞，采用 UniQ柱式总 胞库。流式细胞仪为美国Becton．Dickinson公司产品； RNA提取试剂盒 (上海生工)进行总RNA的提取，实验