缺氧诱导内皮祖细胞中孤儿核受体基因Nur77的表达.pdfVIP

细胞生物学杂志 ChineseJournalofCellBiology2009，31(5)：709—713 http：／／www．cjcb．org 缺氧诱导内皮祖细胞中孤儿核受体 基因Nur77的表达 夏 爽 张 玉 邓松柏 佘 强 (重庆医科大学第二附属医院心血管内科，重庆400010) 摘要 孤儿核受体Nur77蛋 白是早期反应转录因子之一，多种刺激因子如缺氧可诱导其迅 速表达，参与调控细胞增殖、存活、分化等过程。内皮祖细胞移植可治疗缺血性疾病，缺氧是其移 植后主要的早期刺激因素，缺氧诱导下内皮祖细胞的基因表达及其增殖、分化、凋亡的变化 目前 尚不清楚。本文研究了大鼠骨髓来源的肉皮祖细胞缺氧诱导下Nur77基因的表达变化。通过RT— PCR和Western印迹方法检测Ⅳr77mRNA、蛋白质的表达，发现正常氧浓度下内皮祖细胞中Nur77 基因几乎不表达，而 1％氧浓度诱导30min时Nur77基因即迅速表达，其mRNA表达量于缺氧 1h 达到峰值，随后下降，缺氧4h时表达量仍高于正常氧浓度下的表达量(PO．O5)；其蛋白质的表达量 持续增加并于4h达到峰值。本研究证实了大鼠骨髓来源的内皮祖细胞中存在Ⅳr77基因，缺氧 可诱导Nur77基因迅速表达，这种表达可能对内皮祖细胞生物学特性的改变产生影响。 关键词 内皮祖细胞：Nur77；缺氧；孤儿核受体 近年来，缺血性心脏病在我 国的发病率和死亡率 重庆医科大学实验动物中心。M199基础培养基、 呈迅速上升趋势，在传统的药物、手术治疗基础上， 南美胎牛血清、双抗(Hyclone公司)，牛垂体提取物 基因、干细胞移植治疗方式获得可喜的研究进展， (bovinepituitaryextract，BPE，Millipore公司)，碱性成 有望成为一种有效的治疗途径 。其 中内皮祖细胞 纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor， (endothelialprogenitorscells，EPC)在缺血性心脏病的 bFGF，Peprotech公司)，纤连蛋~t(Chemicon公司)，兔 干细胞治疗领域 占据重要的地位…。然而 EPC移植 抗大 鼠CD133抗体(Abcam公司)，兔抗大 鼠CD34 到缺血组织中在缺氧环境下其细胞本身的基因表达 (Millipore公司)，FITC标记 山羊抗兔荧光二抗(中衫金 变化 以及生物学性状如增殖、凋亡等的改变 目前所 桥公司)，6孔板(BD公司)；RNAisoPlus、RT及PCR 知甚少 。 试剂盒购 自大连TaKaRa公司，全蛋 白提取试剂盒购 孤儿核受体Nur77蛋白(又称NR4A1、TR3、 自南京凯基生物有限公司，Nur77兔多克隆抗体购 白 NGFI—B、NAK一1)是NR4A孤儿核受体家族中的一 ABcam公司(1：5OO)，辣根过氧化物酶标记的山羊 员，为即刻早期基因反应产物，目前发现它存在于 内 抗兔二抗(1：1000)购 自北京中杉金桥生物公司， 皮细胞、淋巴细胞、肌细胞等多种细胞中，在受到 Nur77(基因序列号：NM一173157．1)引物 由上海生物 细胞外刺激因素如缺氧作用下迅速表达 ，调控与增 工程公司合成 。 殖、凋亡、炎症相关基 因的表达f21。然而Nur77基 CO，细胞培养恒温箱(美国FormaScientific公 因在EPC中是否表达，以及其表达在缺氧环境中有什 司)，激光共聚焦成像仪(LCS—SP2，Leica公司)，倒置 么变化 尚不清楚。因此，本研究将对体外分离培养 相差显微镜 ／倒置荧光显微镜(Olympus公司)。 的Sprague。Dawley(SD)大 鼠骨髓来源的EPC (bone 1．2 方法 marrow—EPC。BM—EPC)在缺氧环境下^r77基因表达 1．2．1 BM—EPC的采集分离、培养及分