重组人纤溶酶原基因的酵母表达、产物纯化及鉴定.pdfVIP

中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology，2009，29(10)：18～22 重组人纤溶酶原基因的酵母表达、产物纯化及鉴定 陈 武 莫 炜 张艳玲 宋 钢 宋后燕 (1广东药学院生命科学与生物制药学院 广州 510006 2复旦大学分子医学教育部重点实验室 上海 210032) 摘要 目的：研究重组人纤溶酶原丝氨酸蛋 白酶结构域(rhPLG—SP)的酵母表达、纯化及理化性 质。方法： 采用7．5L发酵罐对巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)工程菌rhPLG—SP／GS115进行 高密度培养、甲醇诱导表达rhPLG—SP，培养液经三步纯化：超滤、Sephacryls-100、SP-SepharoseFF， 将活性组分透析后冷冻干燥。等点聚焦电泳、HPLC、质谱分别检测 rhPLG—SP等电点、纯度和分子 量；纤维蛋 白平板、肽底物 S-2403分别测定 rhPLG—SP激活后的纤维蛋 白溶解和酰胺水解活性。 结果：7．5L高密度发酵可获得约为400mg／L培液的表达量，经三步纯化后制备的rhPLG-SP纯度 大于 96％。理化分析显示 rhPLG—SP的等 电点为 7．5～7．8，分子量 ：27877Da，比活性 ： 23．6U／mg。结论：初步建立了rhPLG—SP酵母工程菌的高密度培养、表达及纯化工艺，所制备半 成品活性与血浆提取的PLG相近 ，具备放大生产和应用的潜力。 关键词 巴斯德毕赤酵母 丝氨酸蛋 白酶区 纤溶酶原 纯化 鉴定 中图分类号 Q819 人纤溶酶原 (humanplasminogen，hPLG)是丝氨酸 Sigma公司，YNB、酵母提取物购 自Difeo公司，其余试 蛋白酶家族的重要成员之一。在血液 内，PLG被组织 剂均为国产分析纯；SephacrylS-100、Superdex75、SP— 型纤溶酶原激活剂 (t-PA)激活为纤溶酶 (plasmin， SepharoseFF(AmershamPharmacia公司)，3kDa、50kDa PLM)，发挥溶解纤维蛋 白的作用。长期 以来，PLM被 超滤膜 (美 国Pellicon公司)，ProfluxM12超滤仪 (美 认为是一种极具潜力的直接溶栓药物。由于hPLG分 国)，BIOFLO3000型7．5L发酵罐及C25kC型温控摇 子量大、结构复杂且富含糖链，采用大肠杆菌、各种哺 床 (美国NBS公司)。 乳动物细胞表达重组 hPLG，效率均较低 ’ ，因此对 2 方 法 PLG进行结构与功能的研究及结构改造是近年来研究 的焦点。本室宋钢等 构建了重组 hPLG丝氨酸蛋白 2．1 rhPLG-SP表达菌7．5L罐批发酵 酶区(rhPLG—SP)的基因片段，采用 巴斯德毕赤酵母 采用NBS7．5L发酵罐高密度发酵，发酵条件控制： (Pichiapastoris)表达，表达产物经激活后，具有较好的 温度29．5~C (P—I—D模式)，pH5．1(P—I—D模式)，D．O． 纤溶活性。本实验在此基础上，深入研究了高密度发 35．o(5．0％ (Agit模式)，搅拌300～700r／min(D．O．模 酵和纯化工艺，使其更适合大规模制备，并对其理化性 式) 质进行研究，为纤溶酶的开发利用提供了实验基础。 甘油补加：初始速率为0．6ml／L／h，2h内逐渐升高 至9ml／L／h，此后维持此速率，待 0D 达到 150左右， 1 材 料 停止补加甘油。 Pichiapastoris工程菌 rhPLG—SP／GS115由实验室 甲醇诱导：初始速率为 1ml／L／h，8h内逐渐升高至 自行构建 ，纤溶酶、纤溶酶原、三肽化合物 S-2403购 自 12mlZL／h，以后维持此速度 ，并根据 D．0．值和pH值的