一种改善的水稻成熟胚愈伤组织高效基因转化系统.pdfVIP

植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (3): 322331, w w w .chinbullbotany .com .技术与方法. 一种改进的水稻成熟胚愈伤组织高效基因转化系统 1 , 2 1 1* 陈惠 , 赵原 , 种康 1 中国科学院植物研究所, 光合作用与环境分子生理学重点实验室, 北京100093 2 山西师范大学生命科学学院, 临汾041004 摘要 以成熟胚愈伤组织为材料的农杆菌介导水稻转化法虽已建立, 但转化频率仍有待提高。本文以粳稻( Oryz a sativa) 品 种( 中花10 号和中花1 1号) 的成熟胚诱导的愈伤组织为受体材料, 对组织培养体系及影响遗传转化的因素进行优化, 建立了一 套改进的农杆菌介导的水稻高效遗传转化系统。农杆菌菌株为EHA 10 5 , 质粒载体是p UN 13 0 1/ Os RAA1, 其中含有标记基 因GUS 和筛选基因HP T。愈伤组织诱导培养基为NBD2 (NB+2 m g ·L-12,4-D ), 继代培养基为NBD0 .5 , 预分化与分化培养基 为RE1 (MS +1 m g ·L-16-BA +0.25 mg ·L-1 NAA +0.5 mg ·L-1 KT + 0.2 mg ·L-1 ZT)和RE2 (MS+ 1 mg ·L-1 6-BA + 0.5 mg ·L-1 NAA + 0.5 m g ·L-1 KT + 0 .2 m g ·L-1 ZT )。另外, 还分析了影响T-D NA转移的多种因素, 如外植体种类、愈伤组织预培养基和愈伤 组织继代次数等。采用优化的转化程序, 水稻愈伤组织转化率和植株转化率可达7 0% 以上。 关键词 农杆菌介导的遗传转化, 成熟胚诱导的愈伤组织, 水稻 陈惠, 赵原, 种康 (2008 ). 一种改进的水稻成熟胚愈伤组织高效转化系统. 植物学通报 25 , 322-33 1. 水稻高效遗传转化体系是进行水稻基因功能分析、 1 材料与方法 创建T- DNA 插入突变体库(高东迎等, 2007)和遗传改良 1. 1 植物材料 的基础。利用根癌农杆菌转化水稻成熟胚愈伤组织已 有不少报道(Rashid et al., 1996; 章冰和卫志明, 1999; 粳稻品种中花10 号和中花11 号(Oryz a s ati va ss p. 黄健秋等, 2000 ; Sallaud et al ., 2003), 但大多数情况 j aponica cv. Zhong hua 10, 11)由中国农业科学院李梅 转化频率不高, 较理想的在20%-30%, 低于幼胚来源的 芳提供。 愈伤组织的转化率(黄健秋等, 2000) 。由于成熟胚取材 便利, 不需要温室等设施, 也不受时间和季节的限制, 所 1.2 外植体的种类和消毒 以用成熟胚诱导愈伤组织的转化法备受青睐。 将2 个水稻品种的幼胚、幼嫩种子(开花后10-14 天取 我们用中花10 号和中花11 号2 个水稻品种成熟胚 材)、成熟胚和成熟种子等4 种外植体, 接种在设计好的 愈伤组织为材料, 在优化其高频再生的基础上, 比较分析 培养基上, 于25 °C 、黑暗条件下进行愈伤组织的诱导 愈伤组织继代次数、预培养的培养基组分和农杆菌浓 和继代培养。 度等因素, 优化了以水稻成熟胚愈伤组织为受体材料的 成熟种子的消毒: 先用70%(v/v)乙醇处理3分钟, 再 遗传转化条件, 建立了一套水稻成熟胚来源的愈伤组织 用0 .1% (w/ v)升汞(每升加5-6 滴吐温-80)浸泡12-13 高效遗传转化系统。利用这套水稻转化系统, 我们对本 分钟, 无菌水冲洗4-5 次, 用无菌纸吸干种子表面水分 实验室克隆的多