青枯雷尔氏菌致病性代谢组学异质性研究在青枯雷尔氏菌致病.docVIP

青枯雷尔氏菌致病性代谢组学异质性研究 史怀，刘波*，陈峥，郑雪芳，潘志针，陈梅春，朱育菁 福建省农业科学院农业生物资源研究所 摘要： 关键词：代谢组学，青枯菌，致病性Metabonomic method in Ralstonia solanacearum Pathogenicity Research ShiHuai, LiuBo, ChenZheng, ZhengXuefang, PanZhizhen, Chen Meichun, Zhu Yujing Agricultural Bioresources Research Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，350003, China Abstract: Key Words: metabonomic, Ralstonia solanacearum, Pathogenicity 青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种世界范围的重要土传病害， 可危害包括许多重要经济作物在内的44个科的300多种植物，此外还可以侵染许多杂草和其他非寄主植物的根部。多数作物一旦发病即表现枯萎症状并导致全株死亡，每年造成巨大的农业经济损失[1]。青枯雷尔氏菌存在强致病性菌株和无致病性菌株，前者侵染寄主植物后可导致寄主的发病；后者可以侵染寄主植物，但不引起寄主发病[2]。在自然状态下，青枯雷尔氏菌致病力具有多样性。青枯雷尔氏菌致病力的早期检测，对于预测青枯雷尔氏菌的发生危害，研究其微生态关系具有重要意义。目前，青枯雷尔氏菌致病性的测定方法有：生物测定、选择性培养基测定、脂肪酸测定、离子交换色谱测定、蛋白组学测定等[3-6]。 代谢组学（metabonomics）通过测量生物体代谢产物的种类和浓度变化，分析系列关联生物标记物的综合差异，从而揭示生物系统对基因以及环境变化[7]。微生物的代谢产物在其生长稳定期相对稳定且产量高；同时，微生物的培养条件、样品制备以及代谢组学数据采集方法均人为可控，实验数据具有可重复性。已有将代谢组学分析用于微生物的分类鉴定[]，但不同致病性青枯雷尔氏菌的代谢组学分析判断尚未见报道。1材料与方法 1.1 供试菌株 青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）菌株均为本课题组自行分离保存信息见表1表1 供试菌株菌株编号 致病性 寄主 备注 FJAT-91 强 番茄 采自福州闽侯 FJAT-1448 采自南平建瓯 FJAT-1457 FJAT-1453 弱 番茄 采自南平建瓯 FJAT-1458 FJAT-1463 FJAT-T763 弱 番茄 Tn-5随机插入导致致病性丧失 FJAT-T871 1.2 仪器与试剂 Agilent 1260/6520 Q-TOF LC/MS，配ESI电喷雾离子源；Eppendorf高速冷冻离心机；Sanyo超低温冰箱；甲醇、乙腈、乙酸铵，均为色谱纯。 1.3 样品制备 青枯雷尔氏菌分别接种于TSB培养基中，设2个重复，30 ℃摇床（200 r·min）培养24 h，12000 r·min-1离心去除菌体，上清液中加入等体积的乙腈，12000 r·min-1离心10min，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后保存待测。 1.4 液相色谱与质谱条件 色谱条件：Agilent ZORBAX Extend-C18色谱柱（2.1×50 mm，1.8-Micron）；柱温35 ℃；进样体积10 μL；流动相A为10 mmol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱：0-3 min 10% A，3-15 min 10%-50% A,15-25 min 50% A；25-27 min 50%-10% A，27-35 min 10% A。质谱条件：ESI源；正离子扫描，具体参数见表1表1 LC/MS在ESI离子模式下的操作参数 Table 1 Parameters of LC/MS on ESI positive mode 参数 设定值 毛细管电压 20 V 喷雾器压力 30 psi 干燥气流量 10 L/min 干燥气温度 300 ℃ 碰撞电压 230 V 锥孔体电压 65 V 质量范围（m/z） 100~1000 标准质量 121.050873；922.009798 1.5 数据处理和统计分析 参考史怀等[]的方法，利用Agilent MassHunter 工作站软件（含Qualitative Anlysis和Mass Profiler Professional模块）处理原始MS数据，包括分子特征提取、背景扣除、数据筛选，并进行统