大鼠视网膜干细胞转染绿色荧光蛋白的实验研究.pdfVIP

ChinJIabDiagn，December，2012，Vol16，No．12 文章编号 ：1007—4287(2012)12—2190—04 大 鼠视网膜干细胞转染绿色荧光蛋 白的实验研究 王淑荣，王晨光，齐首楠 ，苏冠方 (吉林大学第二医院 眼科 ，吉林 长春 130041) 摘要 ：目的 观察蛋白质粒转染大 鼠视 网膜干细胞后蛋 白的表达及细胞生长、分化情况 。方法 应用机械一酶消 化法将出生 10d大 鼠的睫状体组织制成单细胞悬液，并应用含 2Ot~g／L表皮生长因子、20~／g／L碱性成纤维细胞生长 因子和 1×B27添加剂在无血清 DMEM／F12培养基 中培养 。取第 2代细胞应用免疫细胞化学染色检测神经干细胞 特异性抗原神经巢蛋 白(nestin)及细胞分裂增殖标志物 5一溴脱氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine，Brdu)的表达。应用 脂质体转染法将含有绿色荧光蛋 白(greenfluorescentprotein，GFP)的质粒 pGCsilencerTM U6／Neo／GFP转染到 RSCs内，转染后应用荧光显微镜观察细胞生长情况，转染后应用 G418筛选，一周后对转染后的细胞应用含 50ml／L 的胎牛血清的培养基进行诱导分化，并应用免疫细胞化学染色方法对于分化后的细胞进行神经元标志物神经元特异 性烯醇酶(neuronespecificenolase，NSE)、神经胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋 白(glialfibrillaryacidicprotein， GFAP)检测。结果 原代细胞培养 2d后在培养基 内可以观察到悬浮的折光性强的小细胞团，45d后细胞团数量 增多且体积变大，7-9d后细胞传代 ，应用免疫细胞化学方法可检测到细胞表达神经标志物 nestin及增殖标志BrdU， 基因转染 1d后即可在细胞 内观察到荧光的表达 ，于转染 2-3d后荧光逐渐增强并可维持较长时间。筛选一周时细胞 基本均表达 GFP。转染后细胞的生长特性未发生明显变化，在 以血清为诱导条件下仍可分化出神经样细胞。诱导第 7日免疫化学染色分别检测 出神经元及胶质细胞标志物 NSE及 GFAP的表达 。结论 来源于睫状区的大 鼠视 网膜 干细胞经基因转染后可在一定时间内稳定表达 ，并且细胞增殖及分化未受到明显影响，实验为下一步进行 RSCs内表 达或抑制特定的 目的基因的实验研究奠定了基础 。 关键词 ：视 网膜干细胞 ；荧光蛋 白；基 因转染 中图分类号 ：R774 文献标识码 ：A Thestudyoftransfeetionproteintoratretinalstem cells W_ANG Shu—rong，W_ANG Chen—guang，Q，Shou—nan，eta1． (EyeHospitalofthesecondHospital，JilinUniversity，Changchun130041，China) Abstract．．0bjective Toobservetheexpressionoffluorescentproteininratretinalstem cellsandtheproliferation anddifferentiationofcellsaftertransfection．Methods Cellsoftheciliarybodyofpostnatal10d ratwereisolated by mechanicalandenzymicmethod，thenwerecultivatedinserum freeDMEM ／F12medium with20 g／IEGF，20g／I bFGFand1×B27Supplement．RSCsofthesecond generationwereidentified bydetectionofnestinand 5-bromode— oxyuridine(BrdU)withimmunocytochemistrystaining，pGCsilenc