传染性造血器官坏死病毒毒株核蛋白基因片段的克隆及序列分析.pdfVIP

第 26卷第3期 大 连 海 洋 大 学 学 报 V01．26No．3 2011年 6月 JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Jun．2011 文章编号：2095-1388(2011)03-0232-06 传染性造血器官坏死病毒毒株核蛋 白 基因片段的克隆及序列分析 韩硕 ，赵前程 ，吴斌2，李叶 ，王玫 (1．大连海洋大学 食品工程学院，辽宁大连 116023；2．辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116001) 摘要：利用RTG～2细胞对传染性造血器官坏死病毒 (IHNV)的敏感性对IHNV—DL进行扩增，采用TR— Iml法提取病毒RNA，用 IHNV核蛋 白基因的一对通用引物进行 RT—PCR扩增，将扩增出的一条 786bp的 基因纯化、克隆至pMD18一T载体中进行序列测定 ，并与国内外已公布的病毒核蛋白基因进行比对和分析。 结果表明：此病毒的核酸序列与标准毒株 RB一1、代表毒株 WRAC的同源性分别为96．3％和 93．6％；翻译 出的氨基酸序列与标准毒株RB一1、代表毒株WRAC的同源性分别为96．1％和93．5％。系统进化树分析结 果表明，此毒株与中国近期公布的毒株 zyx有密切的亲缘关系。 关键词 ：传染性造血器官坏死病毒；纯化；克隆；序列分析 中图分类号：$941．41 文献标志码 ：A 传染性造血器官坏死病 (Infectioushaematopoi— 增，产生典型的细胞病变状态，采用 N基因上一 eticnecrosis，IHN)是一种主要感染大马哈鱼和虹鳟 段高保守性和高特异性的786bp片段的一对通用 鱼苗及其幼鱼的急性、系统性的严重传染病nJ， 引物，对扩增出的病毒进行 RT—PCR鉴定，对其 给全球大马哈鱼和虹鳟的养殖业造成巨大的经济损 结果进行纯化、克隆进而测序 ，并将结果与已公布 失 2J。以前 IHN只在北美及欧洲的一些周家流行。 的各国外毒株和国内毒株 zyx的相应基因及氨基酸 1968年，IHNV随红大马哈鱼鱼卵从阿拉斯加传人 进行了比对和分析，构建其核酸和氨基酸序列进化 日本北海道 J。近年来 ，随着水生动物及其产品 树，从而为IHNV核蛋白基因结构与功能的进一步 进 口贸易的增加，IHN也传人 中国，并在中国一些 研究提供基础资料。 地区流行，在 自然环境中也可以爆发并造成严重的 1 材料与方法 经济 损失 J。所 以 OIE(OfficeInternationalDes Epizooties)将 IHN命为 口岸鱼类第一类检疫病害。 1．1 材料 IHN病原即传染性造血器官坏死病毒 (Infec． tioushaematopoieticnecrosisvirus，IHNV)，属弹状 1．1．1 细胞、毒株和菌种 RTG-2细胞和 IHNV— 病毒科、诺拉弹状病毒属 J，单链负股 RNA，基 DL病毒由辽宁出人境检验检疫局技术 中心动物检 因组全长为 1lkbp。病毒粒子由RNA聚合酶蛋 白 疫实验室提供。大肠杆菌感受态细胞DH5~x由该实 (L)、磷酸化蛋 白(P或 M1)、基质蛋 白(M或 验室制备保存。 M2)、表面糖蛋 白(G)和核蛋 白(N)组成 J。其 1．1．2 主要试剂 逆转录酶AMV、RNA酶抑制剂 中，N蛋 白和病毒 RNA紧密结合 ，并且此结构域 HRP、r-TaqDNA聚合酶、胶 回收 (小量)试剂 和其它已知的与 RNA结合的蛋 白序列间具有高特 盒、pMD18一TVector、质粒 (小量)抽提试剂盒 异性 。