冬虫夏草ISSR-PCR反应体系的建立与优化.pdfVIP

湖南农业科学 2010，(21)：9-12 HunanAgriculturalSciences 冬虫夏草 ISSR—PCR反应体系的建立与优化 谢 放，朱子雄，田 伟，张 楠 (兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃 兰州 730070) 摘 要：为进一步研究冬虫夏草的遗传多样性，试验采用改良的CTAB法提取高质量DNA模板，克服了冬虫夏草中富含多糖、蛋 白、盐类和色素的影响。建立并优化了冬虫夏草 ISSR—PCR最适反应体系，即在 25 L体系中反应物的含量分别为：10xPCR Buffer2．5I．LL，模板DNA20ng，引物 0．9p~mol／L，dNTP0．12mmol／L，Mg2+1．5mmol／L，TaqDNA聚合酶0．5U，引物835号的最适退 火温度为50．8℃。结果表明此反应体系标记位点清晰、稳定、重复性好。 关键词 ：冬虫夏草；ISSR；PCR；反应体系；优化 中图分类号：$567．35 文献标识码 ：A 文章编号：1006—060X(2010)21—0009—04 EstablishmentandOptimizationofISSR-PCR ReactionSystem f0rCordycepssinensis XIE Fang，ZHU Zi-Xiong，TIAN Wei，ZHANG Nan (SchoolofChemicalandBiologicalEngineering,LanzhouJiaotongUniversity,Gansu730070,PRC1 Abstract：ForfurtherresearchonthegeneticdiversityofCordycepssinensis，theimprovedmethodofCTABwas adoptedtoextracthighqualitytotalDNA template，and itcanconquertheinfluencesthatCordycepssinensiscontains abundantkindsofpolysaccharides，proteins，saltsandpigments．TheISSR-PCR optimal reactionsystem wasestablished andoptimized，whichin25IxLreactionmixture，thecontentofeachreactantwasas follows：2．5IxLofIOxPCR Buffer； 2OngofgenomicDNA；0．9p~mol／L ofISSR prime；O．12 mmol／L ofdNTP；1．5mmol／LofM ；0．5U ofTaq DNA polymerase；thesuitableannealingtemperatureforprimer835was50．8℃ ．Theresultsshowedthatthisreactionsystem wasclear,stba leandrepeatedformarkers loci． Keywords：Cordycepssinensis；ISSR；PCR；reactionsystem；optimization 冬虫夏草是我国珍稀名贵中药材之一 ”【。前人 供试物种冬虫夏草分别采 自甘肃省虫草主要 在其分类与遗传多样性方面已经做了许多工作 。 产地：天祝打柴沟镇东山，甘南合作市合作镇扎油 但他们对冬虫夏草遗传多样性的研究，主要依据 沟和甘肃漳县金钟镇路骨山。菌种由兰州交通大学 RAPD、RFLP、ITS技术，而侧重于虫草 ISSR(Inter— 生物种苗工程研究所分离纯化，获得菌株。 simpleSequenceRepeats)分子标记的研究尚未见报 1．1 基 因组DNA提取及定量 道。ISSR是由Zietkiewiez等[51于 1994年提出的用