梅毒螺旋体重组抗原的表达及在梅毒血清学诊断中的应用.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（６）：４１～４５ 梅毒螺旋体重组抗原的表达 及在梅毒血清学诊断中的应用 １ １ １ ２ １ １ 卢海蓉 　王晓红 　陈少娟 　王　峰 　章　刚 　黄德新 （１深圳大学生化工程技术研究中心　深圳　５１８０５７　２　深圳市慢性病防治中心　深圳　５１８０２０） 摘要　目的：克隆、表达梅毒螺旋体（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ，Ｔｐ）膜蛋白ＴｐＮ４７、ＴｐＮ１７、ＴｐＮ４４．５和 ＴｐＮ１５，建立双抗原夹心ＥＬＩＳＡ法，探讨其在梅毒血清学诊断中的应用。方法：应用聚合酶链反应 法（ＰＣＲ）从Ｔｐ全基因组中扩增４个目的片段，克隆到载体ｐＥＴＨＴＪＫＭ中，在 ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ ? ? 菌中诱导表达，ＮｉＮＴＡ亲和层析法纯化重组蛋白，辣根过氧化物酶标记，双抗原夹心酶联免疫吸 ? 附法检测人血清中的特异性ＩｇＭ和ＩｇＧ抗体。结果：成功表达了４种重组蛋白用作ＥＬＩＳＡ包被和 酶标抗原检测国家Ｔｐ参比血清，特异性和灵敏度均为１００％；检测３８５份临床血清样本，结果与 ＴＰＰＡ法相比符合率达到９９％（Ｐ＜０．０１），灵敏度和特异性分别为９８．２％（１６２／１６５）和９９．５％ （２１９／２２０）。结论：表达的４种重组抗原具有很好的生物活性，为理想的梅毒的血清学诊断用抗 原。以这４种表达蛋白为基础建立的双抗原夹心ＥＬＩＳＡ法灵敏度高，特异性好，而且方法简单， 结果客观，易于自动化操作，值得临床大力推广。 关键词　重组蛋白　梅毒螺旋体　双抗原夹心酶联免疫吸附试验 中图分类号　Ｑ８１９ 　　近年来梅毒的发病率在许多国家都呈现明显的上 抗原在梅毒诊断中的临床应用价值。 升趋势，而梅毒至今尚未分离出具有保护性免疫力的 １　材料与方法 抗体，也无有效的疫苗，因此早期诊断早期治疗，防止 血液传播非常重要；同时梅毒患者对人类免疫缺陷病 １．１　材　料 ［１］ 毒（ＨＩＶ）的易感性增高 ，控制梅毒对降低 ＨＩＶ的传 １．１．１　菌株和质粒　梅毒螺旋体ＴｐＮｉｃｈｏｌｓ株购自新 播也有着重大意义。 疆疾病预防控制中心董永惠教授；表达质粒ｐＥＴＪＫＭ由 　　目前国内诊断梅毒常用快速血浆反应素试验 本室保存。表达菌株 ＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｔａｒ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （ＲＰＲ）筛选后再用梅毒螺旋体血凝试验（ＴＰＰＡ）或螺 公司。 旋体血球凝集试验（ＴＰＨＡ）等确证。ＲＰＲ有较高的假 １．１．２　试剂　各种限制性内切酶，Ｔ４ＤＮＡ连接酶，Ｅｘ? 阴性和假阳性，ＴＰＰＡ试验成本高，不能自动化、结果判 Ｔａｑ酶均为宝生物工程公司产品；ＤＮＡ提取试剂盒 断主观。重组抗原ＥＬＩＳＡ是近年发展的检测梅毒的方 ＤＮｅａｓｙＴｉｓｓｕｅＫｉｔ、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒为 法，具有敏感性高、特异性好、自动化程度高、结果标准 ＱＩＡＧＥＮ公司产品；ＩＰＴＧ为上海生工产品；ＰＣＲ引物由 化易于推广等优点。我室以基因工程重组表达的梅毒 上海生工合成；测序试剂盒为 Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司产品； 抗原ＴｐＮ４７、ＴｐＮ１７、ＴｐＮ４４．５和ＴｐＮ１５为基础，建立了 ２＋ ＣｈｅｌａｔｉｎｇＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔｆｌｏｗＮｉ 亲和层析系统为 双抗原夹心法，可同时检测梅毒的ＩｇＭ和ＩｇＧ型抗体， Ｐｈａｒｍａｃｉａ产品；Ｃ１８柱购自Ｗａｔｅｒｓ公司；国家梅毒参比 并与ＲＰＲ和ＴＰＰＡ进行对比研究，以进一