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鲈鱼PPARα基因荧光定量PCR 质粒标准品的构建1 方雯，钱云霞 宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江宁波（315211 ） E-mail ：fangwenwen2006@163.com 摘 要：利用SYBR荧光定量PCR技术，制备用于鲈鱼PPARα基因实时荧光定量PCR检测的 质粒标准品。通过PCR扩增出目的片断，纯化后连接至pMDI8-T载体，转化宿主菌E.coli DH5α，通过PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析，确认重组质粒完整正确，抽提重组质粒， 测定其拷贝浓度，10倍梯度稀释成标准品模板，进行荧光定量PCR分析。结果显示，循环阈 值(ct)与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系。 关键词：鲈鱼；PPARα基因；实时荧光定量PCR；重组质粒；标准品 中图分类号：Q786 文献标识码：A 过氧化物酶体增殖剂激活受体 (peroxisome proliferators activated receptors ,PPAR)是一 类能被内源性脂肪酸以及外源性过氧化物酶体增殖剂(peroxisome proliferators ,PP)激活的甾 体激素受体超家族成员[1,2] 。与其它甾体激素受体一样，PPAR也是配体激活转录因子，通过 与位于某些基因上游的特异的DNA反应元件（peroxisome proliferator responsive element ， PPRE)相互作用而调控基因表达[3] 。目前在哺乳动物、鸟类、两栖动物中发现PPARs存在三 种亚型：PPARα、PPARβ ( 也称PPARδ) 和PPARγ，分别由不同的基因编码。其中，PPARα 的主要功能是激活脂质分解代谢中的相关基因并且与过氧化物酶体增值有关[4] ；PPARβ参与 基础脂质代谢及胚胎植入和生长[5] [6] ；PPARγ则在脂肪细胞分化中起关键作用 。 许多研究发现，一些有机污染物（多环芳烃PAH 、多氯联苯PCB 、雌性激素、某些杀虫 剂和除草剂）能引起鱼体过氧化物酶体增值反应[7] 。近几年来，中外学者在鱼中相继发现不 同亚型的PPAR基因[8,9,10]，以及在各个组织中的分布表达情况，但是具体功能尚不清楚。因 而建立一种高效、灵敏的PPAR基因检测方法至关重要。 实时荧光定量PCR 技术(Real-Time Quantitative PCR)是指在PCR 反应体系中加入荧光基 团，对整个 PCR 反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着 反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线[11] ，通过这个标准曲线对 未知模板进行精确定量分析的方法。而标准品是制备标准曲线的前提，本文介绍了用于实时 荧光定量 PCR 检测鲈鱼 PPARα基因的质粒标准品的构建方法。 l. 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 动物和宿主菌 花鲈购买于宁波水产品大世界， 宿主菌为 Ecoli DH5a ，由本实验室保存。 1本课题得到（1. 国家自然科学基金、鲈鱼 PEPCK 基因启动子的克隆及其 PPARγ 应答元件的鉴定、编号 2. 宁波市科技局、鲈鱼过氧化物酶体增殖作为海洋污染的生物标记物研究、编号 2006A610088.） 的资助。 - 1 - 1.1.2 主要试剂和仪器 TM Trizol Reagent (Invitrogen)，PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit （TAKaRa ）， pMD18-T Vector(TaKaRa) ，Taq DNA 聚合酶、限制性核酸内切酶 SalI 和 EcoRI(TaKaRa)