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DDT污染土壤中微生物的分离与鉴定 Separation and Identify of Microorganism in DDT Contaminated Soil 牛佳1王继华1*辛佳2李文慧1 （1 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，哈尔滨，150025；2清华大学北京；*王继华，E-mail：wangjihua333@） (1 Life Science and Technology College,Harbin Normal University,Harbin,1500252 School of Environment,Tsinghua University,Beijing,100084;* WANG Ji-hua, E-mail:wangjihua333@) 1．引言 DDT又叫滴滴涕，化学名为双对氯苯基三氯乙烷(Dichlorodiphenyltrichloroethane)，是《关于持久性有机污染物POPs的斯德哥尔摩公约》规定的12种禁限POPs之一，是一种耐热、耐酸、脂溶性大、残效期长的有机氯类广谱杀虫剂。20世纪中期曾广泛应用于全世界防治作物害虫和控制疟疾的传播上，为人类的生存起到了一定的积极作用。但是由于其具有致畸、致癌、致突变的“三致”效应、高毒性及难降解的特点，对环境造成了严重的污染。20世纪70年代左右，大部分发达国家包括一些发展中国家开始禁止生产和使用DDT。至今禁用数十年，但在环境中的累计作用仍很严重。因此，采用一定的技术手段修复有高毒、高残留、难降解的有机氯农药造成的环境问题已迫在眉睫。 微生物降解被认为是有机氯农药降解最可靠、最高效的途径。分离筛选高效降解DDT的微生物是人们进行DDT污染治理、土壤生物修复的有效措施。通过筛选DDT降解菌，研究其生物学特性、降解特性及其DDT降解菌发酵条件的优化，为DDT污染土壤的生物修复提供依据，达到恢复土壤生物多样性，保护环境和人类健康的目的。 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 样品来源：广州某船厂DDT污染场地。 2.1.2 实验仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、电热鼓风干燥箱、电子天平、HZQ-F160振荡培养箱、752型紫外分光光度计、超净工作台等。 2.1.3 培养基：(1) 无机盐基础培养基；(2) 分离纯化培养基；(3) LB富集培养基。 2.2 实验方法 2.2.1 菌种的富集及分离：称取2 g土样，加入到无机盐基础培养基(DDT含量50 mg/ L) 中，培养7 d；吸取1 ml培养液加入到新的无机盐基础培养基(DDT含量50 mg/ L) 中，继续培养7 d，这样连续转接3次得到富集培养液。将最后一次富集培养的菌液按照倍比稀释涂布于分离纯化培养基平板上，30℃培养，选取有透明圈的单菌落进行进一步分离纯化。 2.2.菌种形态观察：对8株菌进行菌落形态个体形态观察。 2.2.菌种的生理生化实验：淀粉水解试验，油脂水解试验，甲基红试验，吲哚试验，过氧化氢酶试验，伏普试验，产氨试验，苯丙氨酸脱氨酶试验，葡萄糖发酵试验等。参照文献[]。 2.2.4 细菌生长曲线的测定：将8株菌以相同接种量分别接种于100 mL LB培养基中，置于30℃，150 rpm的条件下振荡培养48 h。以每2 h为一个时间基点，通过752型紫外分光光度仪在600 nm的波长下连续测定8株菌的OD值，并绘制出菌株的生长曲线。 2.2.5 菌种鉴定：根据《伯杰氏细菌学鉴定手册》，主要从菌株个体形态特征、菌落特征、染色反应、生理生化反应等鉴定。 结果与讨论 3.1 形态特征 株菌的菌落形态特征及个体形态特征结果如表1和图1。 表1 8株菌形态特征 菌种 表面形态 隆起 边缘 颜色 粘稠度 透明度 菌体形态 革兰氏染色 5# 圆形 凸起 整齐 淡黄 粘稠 不透明 杆状 - 6# 圆形 凸起 整齐 淡黄 粘稠 不透明 杆状 + 20# 圆形 凸起 不整齐 淡黄 粘稠 不透明 杆状 - 23# 圆形 扁平 不整齐 淡黄 干燥 半透明 棒状 + 24# 圆形 凸起 整齐 淡粉 粘稠 不透明 棒状 + 12-1# 圆形 凸起 整齐 淡黄 粘稠 不透明 杆状 + 12-2# 不规则 凸起 整齐 淡黄 粘稠 透明 杆状 + 12-3# 圆形 凸起 整齐 淡黄 粘稠 透明 杆状 + 注：“+”表示革兰氏阳性菌； “-”表示革兰氏阴性菌 5# 6# 20# 23# 24# 12-1# 12-2#